PDK1信号通路

课题来源：浙江省工业新产品(新技术)研究背景与意义：在国内,一方面,将纺织纤维作为铜、银、锌等无机金属原料的载体的研究依然持续进行中,在另一方面,中国是中医的发源地,一些植物在药理上具有很大的和抗菌能力,并且与无机金属为机理的材料进行相比,纯天然的纤维对人体的舒适度和健康性都更胜一筹。通过双组分复合纺制备皮芯结构,皮层添加一定含量的抗菌粉体。抗菌纳米粉体只分布于纤维的皮层。因此,与共混纺丝法相比,抗菌纳米粉体的用量相对少,从而可以减少抗菌粉体的添加对成品纤维的物理力学性能的影响。复合纺丝制备的抗菌纤维基本满足后道的织造需求,但是该方法生产的抗菌纤维仅限于生产粗旦纤维(如2 dpf 以上),无法满足高端产品的需求。通过纤维镀银法虽然获得的抗菌、纤维抗菌效果好,且也解决了纤维力学问题,但是随之而来的是银氧化发黑变色及安全和成本问题,镀银的纤维表面含有一层单质银,俗称银纤维;但银纤维储存和使用条件要求较为苛刻,在一定范围内low-cost biofiller限制了银纤维的使用范围。通过后整理法在纤维表面交联一层抗菌剂,虽然加工方便,可选择的抗菌剂范围广,在纤维的抗菌加工中比较常用,此法加工的纤维不耐洗涤,抗菌持久性也较差。成果简介：本项目通过低熔点共混纺丝与等离子体改性让抗菌剂复合配方悬浮液直接与纤维结合在一起。目前国内外是首家采用该技术方法生产高效抗菌纤维,该成套技术处于国内外领先水平。通过低温等离子体的高能粒子轰击形D-Lin-MC3-DMA价格成物理、化学反应活化官能团,从而在共混改性纤维表面接枝抗菌纳米颗粒,让抗菌纳米颗粒和纤维的分子链是通过化学Etoposide键或者半熔融粉体粘嵌的方式结合形成一个有机整体。

目的:探讨儿童青少年抑郁障碍患者的肥胖率及相关影响因素。方法:选取抑郁障碍儿童青少年患者757例，收集一般人口学资料及临床数据；评估非自杀性自伤(NSSI)行为；测量体质量及生化指标。结果:儿童青少年抑郁障碍患者的肥胖率为10.4%。肥胖组与非肥胖组比较，发病年龄、首次住院年龄、总病程、住院次数及体质量指数(BMI)、空腹INCB28060纯度血糖、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)及低密度脂蛋白(LDL-C)、Nbio-inspired materialsSSI行为、使用抗抑郁药物种类差异存在统计学意义(P<0.05)。肥胖与总病程、住院次数、空腹血糖、TG、TC、LDL-C及NSSI呈正相关；与年龄、首次住院年龄、HDL-C、使用几种抗抑郁药物及抗抑郁药物剂量呈负相关(P<0.05)。回归分析显示空腹血糖(OR=2.114,P=0.007)、TG (OR=2.086,P=0.001)及NSSI行为(OR=2.103,P=0.IDN-6556说明书010)是抑郁障碍患儿伴肥胖的危险因素，而较高剂量的抗抑郁药(OR=0.970,P=0.015)是肥胖发生的保护性因素。结论:儿童青少年抑郁障碍患者肥胖率较高，且与空腹血糖、TG、NSSI行为及抗抑郁药服用剂量密切相关。

高体重指数(高BMI,肥胖)是一个严重的公共健康问题,”肥胖诱发的氧化应激、炎症和癌症”已成为现代流行病。我们开展这项研究的目的是探索一种可预防肥胖引发的疾病的功能性饮料。中华肉球菌(protective autoimmunityEngleromyces goetzei Henn)凉茶就是这样一种候选产品。在这项研究中,我们对中华肉球菌水提取物(E. goetzMRTX1133纯度ei Henn aqueous extract, Eg H-AE)进行了LC-MS分析,然后使用人体肠道Caco-2细胞系作为模型细胞,并用t-BHP处理细胞以形成氧化应激模型。MTT试验用于检测生物相容性和细胞保护作用;活性氧和丙二醛测定用于评价抗氧化作用;测定TNF-α和IL-1β指BMN 673采购标用于评价抗炎作用;8-OHdG用于监测抗癌活性。研究结果表明,EgH-AE与Caco-2细胞系具有很好的生物相容性,并具有良好的细胞保护、抗氧化、抗炎和抗癌特性。很显然,EgH-AE作为一种古老的凉茶,可以用来开发一种功能性饮料,让体重指数高的人饮用,以预防肥胖引起的疾病。

目的 考察芪黄健脾滋肾颗粒对系统性红斑狼疮血小板减少患者的临床疗效。方法 84例患者随机分为对照组和观察组，每组42例，对照组给予常规治疗，观察组在对照组基础上加用芪黄健脾滋肾颗粒，疗程Immunoprecipitation Kits12周。检测SLEDAI评分、PLT、TPO、IgG、C3、CRP、ESR、IL-17、IFN-γ、血小板表面抗体免疫球蛋白(PAIgG、PAIgA、PAIgM)、安全性指标变化。结果 观察组总有效率高于对照组(P<0.05)。治疗后，2组SLEDAI评分、TPO、IgG、CRP、ESR、炎症因JNJ-42756493供应商子、血小板表面抗体免疫球蛋白降低(P<0.05),PLT、C3升高(P<0.05),以观察组更明显(P<0.05)。2组未发现不良反应。结论 芪黄健脾滋肾颗粒可Baricitinib作用安全有效地改善系统性红斑狼疮血小板减少患者临床症状和免疫功能，升高PLT,降低炎症指标，其机制可能与下调炎症因子、抑制血小板表面抗体有关。

目的 在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)体内构建外源基因以及自身基因的过表达系统。方法 以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因，通过同源重组基因敲入和穿梭质粒两种方法构建Hp中基因过表达体系。同源重组法：以预先构建的基因敲除载体pSJHK的衍生质粒pSJHK4为载体，构建gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,使用Hp鞭毛高表达基因flaA的启动子调控gfp的表达；以hp0547基因区域为插入位点，通过自然转化的方式将质粒转入细菌，胞内通过同源重组将gfp插入到Hp基因组中，荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。穿梭质粒法：将含有鞭毛基因flaA启动子和gfp基因的表C59采购达盒连入H.pylori-E.coli穿梭质粒pCHFHP中，构建表达质粒pCHFHP-gfp,PLX-4720细胞培养自然转化到Hp中，荧光显微镜观察gfp表达的荧光情况。用同样方法构建Hp CagA蛋白(融合有His-tag)的表达质粒pCHFHP-CagA,转入预先构建的Hp CagA敲除株，通过亲和层析纯化重组蛋白，Western blot检测CagA的表达情况。结果 构建了gfp基因敲入质粒pSJHK4-gfp,转入Hp后细菌发出绿色荧光；基于穿梭质粒构建了gfp基因表达质粒pCHFHP-gfp,转入Hp中细菌同样发出荧光；进一步构建了CagA的表达质粒并转入Hp CagA敲除株中，Western blot检测到CagA蛋白，并体外纯化获得一定量蛋白。结论 基于同源重组基因敲入和穿梭质粒的方法可在Hp中构建外源基因及Hp自体基因的过表达体系，该方法能够为Hp的基因功能研究和致病因子的发掘提供基因操Infected total joint prosthetics作工具。

目的考察和评价荷叶碱对MCAO脑缺血模型大鼠及氧糖剥夺PC12细胞的神经保护作用,从G3BP1介导的应激颗粒角度,进一步探讨其神经保护的作用机制。方法1.文献研究利用中国知网(CNKI)、美国国立医学图书馆网络数据库(PubMed)、科睿唯安数据服务平台(Web of Science)、谷歌(Google)等文献数据库和搜索引擎为主要工具,以荷叶碱(Nuciferine)、中风/卒中(stroke)、缺血(ischemia)、应激颗粒(Stress granule)、G3BP1、神经保护(Neuroprotective/Neuroprotection)、MCAO(Middle cerebral artery occlusion)、OGD(Oxygen glucose deprivCompound 3体外ation)、TCM(Traditional Chinese MedicAlpelisib配制ine)等为检索关键词,对脑缺血的病理过程、中药的作用机制、卒中的动物模型、神经保护剂的开发、应激颗粒的形成与解聚、应激颗粒的功能、荷叶碱的理化性质及药理作用机制等方面进行了系统的文献梳理和分析,以期为本研究具体的实验设计和开展提供思路和参考。2.荷叶碱对脑缺血大鼠的保护作用研究选择230-260g的SD大鼠,分为假手术组(sham)、模型组(vehicle),阳性药组(EGb 761,100 mg/kg),荷叶碱低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组。除假手术组外,其余各组均采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。整体药效层面上,Zea-longa五级评分法评价各组大鼠的行为学功能,TTC染色法评价梗死体积,通过对左右脑组织的称重评价其水肿率,并考察各组动物造模后一周内的死亡情况以评价荷叶碱对模型动物生存率的影响。形态学上,苏木精伊红(HE)染色法评价脑组织的病理损伤情况,尼氏染色和Neun免疫组化法评价脑组织中神经元细胞的损伤情况,Tunel和Cleaved Caspase-3免疫组化法评价脑组织中的细胞凋亡情况。采用酶联免疫吸附检测(ELISA)试剂盒或免疫组化法,对血清或脑组织中的TNF-α、IL-1β、NF-kB p65及总抗氧化能力(T-AOC)、GSH/GSSG、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等炎症与氧化应激指标进行了考察,以评估荷叶碱的抗炎及抗氧化的能力。3.荷叶碱抗脑缺血的作用特点及趋势研究本研究采用血清代谢组学和TMNP的研究策略,对荷叶碱抗脑缺血的作用特点进行了研究。代谢组学研究实验将大鼠分为6个实验组,术后24 h腹主动脉采血,离心取血清,经预处理后进行NMR检测。检测方法选择~1D CPMG-presat模式,并采用MestReNova软件进行基线校正及相位调整,面积归一化法对检测数据进行归一化处理。SIMCA-P软件对归一化数据进行进一步的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析,并结合SPSS软件对差异代谢物进行筛选。采用Chenomx NMR Suite database、Human Metabolome Database、KEEG、Metabo Analyst、Met Scape及Cytoscape 3.7.1数据库和软件对差异代谢物进行进一步的鉴定和代谢网络构建。根据网络构建结果得到调控这些差异代谢的关键酶,采用PCR检测方法考察这些关键酶在mRNA水平上的表达。TMNP的研究是基于大鼠MCAO模型,将实验动物分为假手术组、模型组及荷叶碱(40 mg/kg)给药组,术后24 h取大脑皮层半暗带组织,提取mRNA并进行转录组测序。采用TMNP方法,首先分别从UCSC Xena数据库、Cellmarker数据库、Medical Subject Headings(MeSH)结合Pub Med文献数据库、基因本体(GO)数据库、京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中,提取并建立在组织、细胞、病理过程、生物过程、信号通路5个维度上的基因标签信息,再通过关联算法计算荷叶碱诱导的转录图谱,与上述建立的5个维度上的基因标签之间的相似度,即可推断荷叶碱抗脑缺血可能的作用特点和趋势。4.荷叶碱抗脑缺血的作用靶点研究本部分研究内容主要分为基于TMNP的靶点预测、分子对接(Docking)、细胞热转变分析(CETSA)、药物亲和反应的靶点稳定性(DARTS)及生物膜干涉(BLI)五部分。基于TMNP的靶点预测方法首先依托于Connectivity Map数据库,构建靶点的基因标签,再通过关联计算得到荷叶碱可能的靶标信息。Docking研究部分是从数据库中下载了荷叶碱和G3BP1的结构式,经过预处理后,采用Auto Dock软件进行分子对接。CESTA及DARTS实验的考察,首先提取得到细胞的总蛋白,加入一定浓度的荷叶碱(30/60μM),经孵育后,分别在PCR仪中进行梯度加热(37,45,53,61,69,77,85℃)或加入一定浓度的链霉菌蛋白酶,以热解或酶解蛋白,常规western blot法评价荷叶碱对G3BP1热耐受性和酶解耐受性的影响。BLI实验部分主要采用生物分子相互作用仪,获取荷叶碱与G3BP1及其NTF2结构域的结合和解离信息,并通过仪器自带的分析软件进行数据分析,得到荷叶碱与蛋白结合的动力学参数。5.荷叶碱对应激颗粒形成的研究本部分研究采用MCAO大鼠模型和氧糖剥夺的PC12细胞模型分别予以考察。在动物水平上,采用免疫组化法,以G3BP1及TIA1为应激颗粒的标记蛋白,首先评价了荷叶碱是否可以促进脑缺血组织中应激颗粒的生成。在此基础上,采用免疫荧光法,考察了G3BP1和神经元细胞标记Neun、星形胶质细胞标记GFAP及小胶质细胞标记Iba-1的共定位的情况,以评估应激颗粒主要形成于哪种细胞类型,并进一步评价荷叶碱组与模型组脑组织中G3BP1与细胞标记的共定位强度。细胞水平上,采用MTT法首先考察了荷叶碱的安全剂量范围,并在此基础上采用MTT法及Calcein/PI双染,评价了荷叶碱对氧糖剥夺PC12细胞的细胞保护作用。进一步,本研究还采用了si RNA干扰技术,考察了G3BP1基因沉默后,荷叶碱对细胞保护作用的影响。最后,采用免疫荧光共定位的方法,对不同组别的神经细胞进行了G3BP1聚集情况的考察,以评价荷叶碱在细胞水平对应激颗粒的影响。结果1.文献研究广泛而深入的文献研究发现,缺血性脑卒中严重威胁人类健康,临床上对创新型的神经保护药物有着迫切的需求。G3BP1介导的应激颗粒是细胞遭受不利环境刺激下形成的一种亚细胞结构,在调节肿瘤和病毒感染等领域均发挥了重要作用。近年来的研究发现,应激颗粒的形成可抑制脑缺血后神经细胞的凋亡,对其他神经退行性疾病也有着重要的调节作用,这给创新型神经保护剂的开发提供了新的思路和视角。荷叶碱具有明显的抗脑缺血作用,机制涉及抗炎、抗氧化、舒张血管、阻断L-谷氨酸等,但荷叶碱的抗脑缺血作用是否通过应激颗粒来介导,目前尚不清楚。2.荷叶碱对脑缺血大鼠的保护作用研究与假手术组比,模型组出现了明显的神经行为学障碍,TTC染色结果也可以看到一侧脑组织有明显的白色缺血区域,并出现了严重的脑水肿,HE病理结果显示,缺血侧组织有明显的病理损伤,表明动物造模成功。与模型组比,荷叶碱给药组(40 mg/kg)的神经行为学评分及水肿率显著降低(p<0.01),脑梗死体积明显缩小(p<0.05),并可一定程度上延长缺血大鼠的存活时间。此外,荷叶碱(40 mg/kg)还可减轻缺血导致的脑组织病理损伤,降低Tunel和Cleaved Caspase-3阳性细胞数量(p<0.01),升高Nissl和Neun阳性细胞数量(p<0.01),降低脑组织或血清中MDA、IL-1β及TNF-α含量(p<0.05或p<0.01),减少脑组织中IL-1β及NF-kB p65的阳性细胞数(p<0.05或p<0.01),提高总抗氧化能力(T-AOC)、GSH/GSS比例及SOD活性(p<0.05或p<0.01)。这些结果提示,荷叶碱具有明显的抗脑缺血作用,该作用或与抗炎、抗氧化及抑制细胞凋亡有关。3.荷叶碱抗脑缺血的作用特点及趋势研究通过血清代谢组学的研究,在血清中共检测到39个内源性小分子代谢物。PCA的分析结果表明,各组的聚类得到了良好的分离,且荷叶碱给药组位于模型组和假手术组之间,提示荷叶碱具有改善缺血导致的内源性小分子紊乱的作用。通过进一步分析,共有19个差异代谢物被识别,与模型组比,荷叶碱干预后精氨酸,异亮氨酸,谷氨酸,鸟氨酸,组氨酸,二甲基甘氨酸,甜菜碱,甘氨酸,谷氨酰胺,葡萄糖,甘油,肌酸,丝氨酸,尿素,酪氨酸共15种代谢物显著升高,4种代谢物包括乳酸,赖氨酸,苏氨酸,胆碱显著降低。这些差异代谢物可富集到9个核心的代谢通路并与15个关键代谢酶有关。通过对差异代谢物、代谢通路及代谢酶的综合分析,发现荷叶碱对内源性小分子代谢物的综合调节,主要与干预脑缺血后的兴奋性毒性、炎症、氧化应激等生物和病理过程有关。另外,本研究还采用TMNP实验方法,建立了31个组织、2431个细胞、437个病理过程、5864个生物过程及345个信号通路的特异性基因表达谱。转录组数据的聚类热图和PCA结果显示,各样本在组内差异较小,组间差异明显。差异基因分析结果显示,共667个基因的表达发生了逆转,这些差异基因可显著富集到mRNA surveillance pathway、response to endogenous stimulus等应激相关通路,divalent metal ion transport、calcium ion transport等金属离子转运等25个信号通路及52个生物过程。TMNP关联分析结果表明,荷叶碱在组织水平上对脑和脾,细胞水平上对星形胶质细胞和神经祖细胞有着较好的逆转作用,对inflammatory response、necrosis、response to cytokine等免疫与炎症等过程,serotonergic synapse、axon guidance、synaptic signaling等神经突触相关过程以及血管重构生物过程blood vessel morphogenesis、angiogenesis、blood vessel development等均有明显的调节作用。TMNP的研究结果提示,荷叶碱有可能通过调节中枢脑或者外周脾介导的多个免疫和炎症生物过程,发挥脑缺血后的神经保护作用。4.荷叶碱抗脑缺血的作用靶点研究本研究中,首先通过TMNP策略,构建了4540个基因靶标的特异性基因表达谱,并通过关联计算,将荷叶碱的潜在靶点聚焦到打分最高的G3BP1。随后再分子对接技术,发现荷叶碱与G3BP1的结合能为-9.4 kcal/mol。CETSA研究表明,随着温度升高,G3BP1蛋白条带信号明显减弱,但相对于阴性对照组,荷叶碱(60μM)预孵育组在温度高于61℃时,蛋白条带信号明显更高(p<0.05或p<0.01)。DARTS实验也发现,与链霉菌蛋白酶组比,荷叶碱(30/60μM)预孵育组的蛋白条带信号显著增强(p<0.05或p<0.01)。BLI实验结果显示,荷叶碱与G3BP1及其NTF2结构域均有良好的结合能力。这些研究结果提示,荷叶碱可能与G3BP1蛋白的NTF2结构域相结合,进而发挥生物学功能。5.荷叶碱对应激颗粒形成的研究大鼠脑组织缺血半暗带的免疫组化结果表明,与假手术组比,模型组中TIA1和G3BP1阳性细胞数显著增加(p<0.01),与模型组比,荷叶碱(40 mg/kg)组中TIA1和G3BP1的阳性细胞数进一步增加(p<0.01),各组之间G3BP1的变化趋势相对于TIA1更为明显。免疫荧光共定位实验显示,G3BP1主要与神经元细胞标记Neun存在共定位,且相比较于模型组,荷叶碱(40 mg/kg)组中存在荧光共定位的细胞数更多。细胞实验显示,荷叶碱(60μM)可显著提高OGD诱导PC12细胞中含有应激颗粒的细胞数量(p<0.01)和细胞活性(p<0.01)。然而MTT结果显示,荷叶碱促进PC12细胞存活的作用,在si RNA-G3BP1后被明macrophage infection显抑制(p<0.05)。本研究结果提示,脑缺血后应激颗粒主要在神经元细胞中形成,而荷叶碱可增加MCAO大鼠脑组织及氧糖剥夺的PC12细胞中应激颗粒的数量,体外细胞实验也证实了其神经保护作用是通过应激颗粒介导的。结论荷叶碱可改善局灶性脑缺血大鼠的神经行为学功能,缩小脑梗死体积,降低脑水肿率,减轻缺血脑组织的病理损伤,具有明显的抗脑缺血作用。该作用与促进G3BP1介导的应激颗粒形成,干预免疫及炎症反应,调节氧化应激等状态有关。

随着我国人口的老龄化,selleck化学神经退行性疾病的发病率呈明Laduviglusib说明书显上升趋势.神经退行性疾病的主要特征为大脑和脊髓特定神经元的进行性丢失,并伴随认知和运动障碍等神经功能障碍.常见的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)、亨廷顿病(Huntington′s disease,HD)、帕金森病(Parkinson′s disease,PD)和肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等.近年来的研究表明,生长停滞和DNA损伤诱导蛋白(growth arrest and DNA damage-inducible protein Empirical antibiotic therapy34,GADD34)与神经退行性疾病密切相关. GADD34是蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)的调节亚基,当细胞受到氧化应激、内质网应激和病毒感染等压力时被诱导表达,从而促进细胞的压力适应以及稳态恢复.然而,GADD34在神经退行性疾病患者及其小鼠模型中表达异常,并在其病理发生过程中发挥重要作用.因此,GADD34也成为治疗神经退行性疾病的潜在靶点.本文主要对GADD34在神经退行性疾病中的作用进行简要概述和探讨.

目的 研究芪藤消浊颗粒通过调控miR-194-5p/Syk/NF-κB信号轴治疗慢性肾小球肾炎(CGN)大鼠的作用机理。方法 SD大鼠通过尾静脉注射阿霉素复制CGN模型，模型建立成功后，随机分成模型组、芪藤消浊颗粒低(5.4 g/kg)、中(10.8 g/kg)、高(21.6 g/kg)剂量组和黄葵胶囊组(1.0g/kg),各组大鼠连续一月灌胃相应药物或溶媒。末次给药后，检测各组大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量及变化。HE染色法检测CGN大鼠肾组织的病理改变。RT-PCR检测肾组织中CB-839miR-194-5p、Syk、p50、p65、Fos mRNA的表达；Western blot检测肾组织中Syk、p-Syk、p50、p65、Fos蛋白表达；双荧光素酶实验验证Syk与miR-194-5p之间的相互作用。结果 芪藤消浊颗粒可以显著降低24 h尿蛋白、血清BUN和血清Scr水平。HE病理学观察表明芪藤消浊颗粒可改善CGN大鼠肾小球萎缩、肾小球基底膜变厚和炎症细胞浸润NSC 119875供应商。芪藤消浊颗粒可降低肾脏组织中Syk、p50、p65、Fos mRNA及Syk、p-Syk、p50、p65、Fos蛋白的表达水平，升高miR-194-5pmRNA表达水平。双荧光素酶实验表明miR-194-5p可能通过结合Syk 3’UTR来调控Syk的表达。结论 芪藤消浊颗粒可能通过调alkaline media控miR-194-5p/Syk/NF-κB信号通路，减轻肾组织炎性反应，治疗CGN。

研究背景塑料作为一种人造材料,因成本低、坚固耐用且易于生产,被广泛应用于各行各业当中。微纳塑料(Micro-/nano-plastics,MNPs)在陆地、水生和大气系统等自然生态系统中无处不在。由于MNPs具有较大的比表面积和较强的表面疏水性,它们很容易吸附和富集重金属和有机污染物等。此外,大多数塑料产品在成型过程中添加了一些塑料添加剂以改变聚合物的性能,使塑料产品更耐用和可持续。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl Phthalate),DEHP)是一种广泛用于塑料制品生产的增塑剂,被应用于塑料产品、化妆品、玩具以及medical reference app医疗器具等产品中,这些塑料添加剂可以在塑料制品破碎过程中以微塑料的形式释放到环境中。聚苯乙烯(Polystyrene,PS)产量高、分布广泛且对疏水性有机污染物具有较强吸附能力,因此,PS和DEHP在生态环境中极有可能造成复合污染,然而目前PS与DEHP联合暴露毒性研究仍然非常有限,PS能否载带和释放DEHP到体内以及联合暴露是否会给神经系统带来更大的危害,目前尚不清楚。研究目的本研究依据环境暴露浓度选择三种微、纳尺度PS粒子和DEHP,通过建立小鼠亚慢性长期口服暴露模型,评价PS与DEHP联合暴露对小鼠神经行为的影响,并探究其毒性作用的分子机制,为MNPs与环境污染物复合暴露的健康风险评估提供研究数据和参考。研究方法1.PS材料表征以及对DEHP的吸附。我们采用扫描电子显微镜观察PS粒子的形态,采用纳米粒度分析仪检测PS粒子水动力学直径和Zeta电位,采用傅里叶红外光谱检测PS材料的成分,采用共聚焦显微镜拍摄荧光信号,确定尼罗红标记PS粒子是否能产生稳定的荧光。其次我们采用气相色谱-质谱联用仪(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)检测DEHP在PS上的吸附量。2.PS和DEHP联合暴露亚慢性暴露动物模型建立。将小鼠随机分为9组:空白对照组(C组),溶剂对照组(SC组),DEHP组,PS组(PS50/500/5000),PS与DEHP复合暴露组(PS50/500/5000+DEHP)。PS和DEHP给药剂量分别为50mg/kg·bw/day和0.5 mg/kg·bw/day,灌胃染毒90 d。3.PS和DEHP联合暴露在小鼠体内分布及整体毒性效应。通过共聚焦显微镜和荧光比色法检测荧光PS粒子在小鼠脑、肠、肝、肾、睾丸和血液中的蓄积。采用GC-MS检测DEHP和其初级代谢产物邻苯二甲酸-单-2-乙基己酯(Mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)在小鼠脑、肠、肝、肾、睾丸和血液中的蓄积。采用全自动血液细胞分析仪检测血常规,使用全自动生化分析仪检测血清中血生化指标。通过ELISA方法检测血清炎性指标,应激激素和雄激素。根据试剂盒检测血清中氧化应激水平。4.PS和DEHP联合暴露神经毒性效应。暴露结束后采用旷场、水迷宫和避暗实验对小鼠的行为和学习记忆能力进行评价。通过HE染色、尼氏染色和电镜观察小鼠海马和皮质结构变化。通过FITC-Dextran染色检测小鼠血脑屏障通透性。采用免疫荧光方法检测海马血脑屏障紧密连接蛋白,小胶质和星形胶质细胞激活标志物,性激素受体相关蛋白表达。采用免疫组化检测海马炎性因子的表达。采用荧光比色法检测海马活性氧水平并根据试剂盒检测氧化应激水平。通过TUNEL实验检测海马组织的凋selleck NMR亡率。通过WB实验检测海马NF-κB通路,凋亡和自噬相关蛋白。采用靶向代谢组学和ELISA检测海马神经递质水平。5.磷酸化修饰蛋白质组学分析及验证。我们采用磷酸化修饰蛋白质组学技术,分析PS50和DEHP单独及其联合暴露对小鼠海马磷酸化蛋白组学的影响,采用WB实验检测阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)相关通路蛋白表达。采用甘氨酸银染检测海马老年斑和神经缠绕成结现象,通过比色法和ELISA检测相关神经递质谷氨酸和D-丝氨酸水平,采用比色法检测Ca~(2+)水平。6.体外小鼠海马神经元细胞(HT22)暴露模型构建。通过50 nm PS和MEHP干预HT22细胞24h,通过CCK8法检测细胞活力,使用共聚焦显微镜观察HT22细胞对荧光50 nm PS的摄取,通过GC-MS检测HT22细胞对MEHP的摄取,采用荧光比色法检测HT22细胞活性氧水平并根据试剂盒检测氧化应激水平,HT22细胞在预先用或者不用N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)抑制剂美金刚(Memantine,MEM)和三磷酸肌醇受体(Inositol 1,4,5-triphate receptor,IP3R)抑制剂光溜海绵素C(Xestospongin C,Xe C)处理的情况下,再用相应浓度的PS50和MEHP单独及其联合暴露处理后,通过Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡,通过比色法检测Ca~(2+)和D-丝氨酸含量,通过ELISA法检测Glu含量,通过WB检测AD通路相关蛋白。7.小胶质细胞(BV2)及与HT22细胞共培养模型建立。通过50 nm PS和MAMG510EHP干预BV2细胞24 h,通过CCK8法检测细胞活力,使用共聚焦显微镜观察BV2细胞对荧光50 nm PS的摄取,通过GC-MS检测BV2细胞对MEHP的摄取,通过ELISA检测BV2炎性因子,Annexin V-FITC/PI双染色法检测共培养细胞凋亡,通过比色法检测共培养细胞Ca~(2+)含量,采用WB方法检测BV2细胞p-NF-κB p65(Ser 536)和HT22/BV2共培养细胞AD标志蛋白的表达。8.肠-脑轴机制探讨。通过HE染色和电镜观察小鼠结肠结构变化。采用免疫荧光检测肠道屏障以及性激素受体相关蛋白,采用ELISA方法检测结肠炎性因子和重要神经递质水平。通过16S r DNA基因测序检测肠道菌群的变化,通过靶向代谢组学检测短链脂肪酸含量。研究结果1.PS和DEHP在体内分布规律及其整体毒性效应。PS能够吸附DEHP且吸附量在98%以上。PS均能进入小鼠血液,50 nm PS在脑、肠、肝、肾和睾丸中均有显著蓄积,500 nm PS在肠、肝、肾和睾丸中显著蓄积,且50和500 nm PS更易在肠中富集,5μm PS在小鼠肝和肾中显著蓄积且更易在肝中富集。PS与DEHP复合暴露后,PS能够载带DEHP并显著增加其在脑、肠、肝、肾、睾丸和血液中的含量;同时显著增加脑内MEHP含量,尤其是50 nm PS与DEHP复合暴露后脑内MEHP含量最高。PS单独及其与DEHP复合暴露后,DEHP和MEHP在体内的含量均呈现粒径依赖性,PS粒径越小其含量越高。PS与DEHP单独及其联合暴露能使血常规、肝功能、肾功能和血脂指标发生变化,并影响血清炎性因子、氧化应激、应激激素和雄激素水平。联合暴露能够增加单独暴露诱导的整体毒性,并随粒径增大其影响逐渐减弱。2.PS和DEHP单独及其联合暴露的神经毒性效应。PS和DEHP联合暴露能够影响小鼠运动活动,导致焦虑行为幷使学习记忆能力下降。PS和DEHP单独及其联合暴露均会损伤小鼠海马和皮质的结构,增加海马血脑屏障通透性,诱导神经炎症,影响氧化应激水平,导致海马凋亡和自噬增加,降低性激素受体水平,还导致海马内多种神经递质的改变,联合暴露会增加单独暴露诱导的神经毒性,并随粒径增大其影响逐渐减弱。3.PS和DEHP单独及其联合暴露诱导小鼠AD样病变及机制探讨。我们通过分析差异磷酸化蛋白肽段,筛选出AD信号通路,发现老年斑和神经纤维缠绕成结的现象,上调AD标志蛋白Aβ_(1-42)及APP、Tau、p-Tau(Ser396)和p-Tau(Thr231),NMDAR Ca~(2+)通道相关神经递质Glu和D-Ser及Grin2b、p-Grin2b(Tyr 1472)、Grin1和p-Grin1(Ser 890)蛋白,IP3R Ca~(2+)通道相关蛋白GPCR和IP3R,Ca~(2+)及下游激酶Ppp3cb和p-ERK1/2(Thr 202/Tyr 204)蛋白,内质网应激相关蛋白Bip、p-PERK(Thr 982)、p-el F2α(Ser 51)、ATF4、CHOP和C-Caspase12水平,下调了p-GSK3β(Ser 9)蛋白水平。与单独PS50和DEHP暴露相比,PS50和DEHP联合暴露导致上述指标的变化更显著。4.PS与DEHP联合暴露诱导AD病变的直接作用分子机制。我们通过建立HT22细胞模型对其机制进行研究,结果表明,PS50+MEHP能导致HT22细胞活力下降,50 nm PS能够进入细胞,MEHP含量增加,影响氧化应激水平,上调了AD重要的标志蛋白Aβ_(1-42)及APP和p-Tau(Ser 396),NMDAR Ca~(2+)通道相关神经递质Glu和D-Ser及p-Grin2b(Tyr 1472)和p-Grin1(Ser 890)蛋白,IP3R Ca~(2+)相关GPCR和IP3R蛋白,Ca~(2+)及下游激酶Ppp3cb、GSK3β和p-ERK1/2(Thr 202/Tyr204)蛋白,内质网应激相关蛋白Bip、p-PERK(Thr 982)、p-el F2α(Ser 51)、ATF4、CHOP和C-Caspase12,凋亡率及凋亡蛋白Bax、C-Caspase9和C-Caspase3,自噬相关蛋白Beclin1和LC3的蛋白表达水平;下调了激酶p-GSK3β(Ser 9),凋亡蛋白Bax,自噬蛋白p62的蛋白表达水平;与单独PS和MEHP暴露相比,50 nm PS与MEHP联合暴露导致上述指标的变化更显著。并且,给予NMDAR抑制剂MEM和IP3R抑制剂Xe C干预后,能够明显缓解PS50与MEHP联合暴露诱导的AD样病变相关蛋白及信号通路的表达。5.PS与DEHP联合暴露诱导AD病变的间接作用分子机制。通过建立BV2细胞及HT22/BV2共培养细胞模型对其间接机制进行研究,我们发现PS50与MEHP联合暴露能导致BV2细胞活力下降,PS50进入细胞,胞内MEHP含量增加,诱导BV2细胞炎症,上调HT22/BV2共培养细胞凋亡率、Ca~(2+)水平及Aβ_(1-42)和p-Tau(Ser 396)蛋白水平,且与单独PS50和MEHP暴露相比,PS50与MEHP联合暴露导致上述指标更显著的变化。6.肠-脑轴机制探讨。PS和DEHP单独及其联合暴露均能损伤小鼠结肠的结构,增加肠屏障通透性,诱导肠炎症,降低性激素受体水平,改变神经递质水平,联合暴露能够增强单独暴露的毒性作用,并随着PS粒径的减小毒性作用逐渐增强。同时,一些肠道菌群(如Ileibacterium、Acetitomaculum、Desulfovibrio和Oligella)及其代谢产物发生特异性改变,并且与神经行为异常、血脑屏障损伤、神经炎症、神经递质和激素水平呈显著相关性。研究结论1.三种粒径PS粒子均能进入小鼠血液中并在组织中蓄积,与粒径大小有关。PS能够载带DEHP,二者复合暴露后促进DEHP及MEHP进入血液并在各组织中蓄积。MEHP在脑内蓄积最多,提示脑是一个重要靶器官。DEHP和MEHP在体内的含量与PS粒径密切相关,粒径越小其含量越高。2.PS和DEHP单独及其联合暴露诱导机体炎性损伤、氧化应激及激素水平紊乱,联合暴露的毒理效应更显著,且小粒径的作用效果明显大于大粒径。3.本研究从体内外实验证明,PS和DEHP单独及其联合暴露均具有神经毒性,且PS粒径越小毒性效应越高。通过NMDAR和IP3R Ca~(2+)通道导致Ca~(2+)超载,最终诱导小鼠和神经元细胞出现AD样病变,联合暴露引起的毒性效应高于单独暴露。4.PS与MEHP联合暴露可以通过激活小胶质细胞NF-κB信号通路,促其释放炎性因子,进而诱导神经元损伤。5.PS与DEHP联合暴露可引起小鼠肠道菌群及其代谢产物的改变,破坏肠屏障并通过肠脑轴途径发挥神经毒性作用。

目的：观察越婢汤加味对慢性肾小球肾炎患National Ambulatory Medical Care Survey者的成效及对生化指标、氧化应激反应的作用Staurosporine作用。方法：选取2021年1月—2022年6月我院收治的慢性肾小球肾炎患者100例，按随机数字法分观察组和对照组，各50例，对照组予常规西医内科综合治疗，观察组在此基础上服用越婢汤加味治疗，比较两组治疗前及治疗后1、3个月的临床疗效、中医证候总积分、生化指标和氧化应激。结果：治疗后，观察组治疗总有Tofacitinib纯度效率明显高于对照组(P<0.05);治疗后1、3个月两组的主证、次证积分及证候总分均明显降低(P<0.05),且观察组明显低于对照组(P<0.05);治疗后1、3个月两组的血肌酐(scr)、24h尿蛋白定量(24hUTP)、尿素(Urea)均明显降低，且观察组明显低于对照组(P<0.05);治疗后1、3个月两组的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)均明显上升，丙二醛(MDA)明显下降(P<0.05),且观察组SOD、GSH-Px均明显高于对照组，MDA明显低于对照组(P<0.05)。结论：越婢汤加味治疗CGN患者疗效好，可有效减轻患者临床症状，改善患者肾功能。