α-L-鼠李糖苷酶属于糖苷水解酶,可特异性催化如芦丁、橙皮苷、柚皮苷、人参皂苷等天然糖苷末端的α-L-鼠李糖基。作为一类重要的生物催化剂,其广泛存在于自然界,在食品、医药、美容、化工等行业具有极高的应用价值。然而,目前缺乏高效、特异性的、针对α-L-鼠李糖苷酶催化活性的评价方法,且缺少稳定性好,催化活性高的α-L-鼠李糖苷酶。急需开发高效的建库策略以快速获得性能优良的α-L-鼠李糖苷酶,从而促进其在工业生产中的发展与应用。本研究首先对4种柑橘类黄酮二糖苷橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷及其对应苷元橙皮素与柚皮素在酸性、碱性和甲醇三种条件下进行250 nm-5PARP抑制剂50 nm波长扫描。结果显示柑橘类黄酮二糖苷与其对应苷元在碱性条件下具有光谱差异性,即苷元在碱性条件下于320 nm处有特征峰。因此,可通过α-L-鼠李糖苷酶对柑橘类黄酮二糖苷脱鼠李糖基将其转化为黄酮葡萄糖苷,偶联β-D-葡萄糖苷酶催化黄酮葡萄糖苷生成对应苷元。利用紫外-可见分光光度法测定320 nm处吸收值对苷元进行定量,从而实现对α-L-鼠李糖苷酶催化柑橘类黄酮二糖苷活性的评价。基于以上研究,本课题选取了一系列肠道细菌源α-L-鼠李糖苷酶HFM-RhaA、HFM-RhaC、HFM-Rha78、BtRha78A、BtRha78D联合嗜热、高活性β-D-葡萄糖苷酶Tn Bgl1A-DM,通过紫外-可见分光光度法快速评价其对4种柑橘类黄酮二糖苷的底物选择性。研究结果表明:HFM-RhaA、HFM-Rha78和BtRha78D对新橙皮苷和柚皮苷的催化活性较高(偏好水解α-1,2糖苷键),BtRha78A可特异性水解橙皮苷和芸香柚皮苷(α-1,6糖苷键),而对新橙皮苷和柚皮苷无水解活性。HFM-RhaC对4种柑橘类黄酮二糖苷均可水解CL13900细胞培养,其中,催化橙皮苷和芸香柚皮苷的能力较强(偏好水解α-1,6糖苷键)。随后,固定酶浓度与反应时间,通过高效液相色谱法检测以上5个α-L-鼠李糖苷酶对4种柑橘类黄酮二糖苷的催化活性,色谱峰图显示结果与上述一致,证实了紫外-可见分光光度法的可行性。其次利用新型半理性分子改造策略—六密码子组合突变(Six Codons Combinatorial Mutagenesis,SCCM)对来源于多形拟杆菌的α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A进行分子改造,以提高其对橙皮苷的催化活性。基于BtRha78A三级结构、同源序列比对等相关信息的分析,确定底物结合口袋入口处的三个突变靶标基序。利用全质粒PCR构建六密码子组合突变体文库、紫外可见-分光光度法初筛、高效液相色谱法终筛,经测序获得4个水解能力高于野生型的优秀突变体,分别是TM1-6-F5、TM1equine parvovirus-hepatitis-6-H6、TM1-7-G1、TM1-8-F9。高效液相色谱法检测野生型和突变体对橙皮苷的生物转化率与反应时间的关系。其中,TM1-6-F5催化橙皮苷的活性最高,当反应时间为20 min时,转化率已达50.67%,而野生型在反应时间为60 min时,对橙皮苷的生物转化率仅有53.97%。最后,对优秀突变体的酶动力学常数、热稳定性、底物选择性等参数进行测定。结果显示,突变体的各项动力学常数均大于野生型、TM1-6-F5的催化效率最高,k_(cat)/K_M是野生型的1.4倍。4个突变体的热稳定性相对野生型有所下降,其中,TM1-6-F5、TM1-8-F9在37℃下的热稳定性较好,保温240 min仍具有95%以上的酶活。此外,通过底物选择性的测定发现,4个突变体对目标底物橙皮苷、芦丁、pNPR的催化活性相较于野生型均有不同程度的变化。