过敏性结膜炎(Allergic Conjunctivitis,AC)是临床上最常见的过敏性疾病之一,是结膜频繁接触外周环境中的变应原(如花粉、灰尘、动物毛发等)引起的一种超敏反应。临床代表性的主观症状为眼痒、异物感和眼分泌物。根据流行病学统计,AC患病人群每年高达15-40%,儿童患病率占发病人口的30%,该病发病率高、复发率高、病程长、疗效有限等特点给患者造成巨大的生理和心理压力,重则成为常年迁延不愈的慢性疾病,因此成为眼科难治性疾病之一。目前临床上常规的治疗手段包括抗组胺药、肥大细胞稳定剂、免疫抑制剂、糖皮质激素类药物以及非甾体类消炎药,以上治疗手段有时难以取得满意的疗效,有维持疗效的时间短、易引起激素性青光眼等副作用,且缺乏抑制复发的有效药。因此,延长药物作用时间、长期有效防止AC复发成为AC研究的重点方向。近年来不断有研究表明,MAPK信号通路在一些过敏性疾病的发病过程中起到的关键作用,AC作为世界上最常见的过敏性疾病之一,其经典发病机制主要是变态反应发生后,Th1/Th2之间的免疫平衡被打破,过敏原与IgE抗体相结合,刺激嗜酸粒细胞和中性粒细胞的增生、活化,使肥大细胞脱颗粒,激活释放炎性介质(组胺、前列腺素、白三烯、血小板活化因子等),从而使眼部出现结膜水肿、充血等炎症表现,MAPK信号通路被证实能够调控Th1/Th2平衡、影响炎性因子表达,提示MAPK相关蛋白可能是防治AC的关键。七味舒敏方在川椒方的基础上去蛇床子等优化组方,旨在规避药物毒性,使其能够长期安全运用于临床。该方在临床应用有显著的治疗效果,基于“寒热相抟”的复杂病机,反复提炼、化裁,自拟而来。我们在前期的研究中,发现川椒方能够降低血清中HIS,IL-6和TNF-α的表达,稳定肥大细胞,抑制其脱颗粒。因此,本次研究选取MAPK信号通路作为研究七味舒敏方防治AC的目标通路,以期揭示七味舒敏方的抗炎免疫机制,为七味舒敏方广泛长期安全应用于临床及新药研发提供理论依据。研究目的基于MAPK信号通路,研究七味舒敏方对卵清蛋白诱导的过敏性结膜炎小鼠的抗炎免疫机制。研究方法BALB/c小鼠分别于实验第0、7、14天腹腔注射OVA与佐剂AI(OH)3混合物基础致敏,后每天采用OVA、生理盐水混合物局部每日点眼1次,连续17d激发,于激发第3天根据小鼠眼部症状判定模型建立。按照随机分组的原则将造模成功的小鼠随机分为模型组、七味舒敏方治疗组(中药高、中、低剂量组)、阳性药物对照组(奥洛他定组)、阴性对照组,与空白组共计7组,每组8只。干预方法:阳性药对照组应用0.1%盐酸奥洛他定滴眼液,中药治疗组应用七味舒敏方干预治疗两周。检测方法:在末次OVA激发20min后,进行眼部症状评分,固定小鼠头部,拍摄小鼠眼部照片。末次激发24h后,以摘眼球法采血。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清OVA-sIgE、TNF-α、HIS、IL-4及IFN-γ含量。取小鼠结膜及眼睑组织,采用HE、甲苯胺蓝染色法对各组小鼠结膜眼睑切片进行染色,采用光学显微镜观察小鼠结膜的病理改变。采用Western Blot法测定小鼠结膜组织MAPK信号通路相关蛋白ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38和P-P38表达含量。结果1.裂隙灯下观察眼睑及结膜组织病理学改变和眼部症状评分:在末次激发20min后,裂隙灯下观察可发现空白组无过敏症状,眼部睁开自然,fetal head biometry眼睑厚度正常,无溢泪、分泌物,不畏光,模型组及阴性对照组较空白组小鼠出现明显的过敏症状,包括眼睑肿胀,眼部睁开吃力,溢泪、黏性分泌物增多等,阳性药物对照组和七味舒敏方各剂量组均不同程度减轻眼部症状,其中七味舒敏方低剂量组仍可见明显的眼部肿胀,眼睑充血,少量溢泪,眼部睁开稍有困难;七味舒敏方中剂量组、七味舒敏方高剂量组及阳性药物对照组可见眼睑肿胀缓解或消失,未见溢泪、黏性分泌物,眼睑充血减轻,眼部睁开自然不吃力。与空白组比较,模型组及阴性对照组小鼠眼部症状评分显著上升(P<0.05),与模型组及阴性对照组比较,阳性药物对照组及七味舒敏方各剂量组小鼠眼部症状评分显著下降(P<0.05),模型组与阴性对照组组间无显著性差异(P>0.05)。2.光学显微镜下观察HE、甲苯胺蓝染色后的结膜及眼睑标本:在光镜下观察可见,空白组小鼠结膜组织完整,未见水肿增厚,结膜上皮细胞排列整齐,结膜上皮和固有层中未见炎性细胞浸润,偶见肥大细胞,未存在明显脱颗粒现象。模型组及阴性对照组可见结膜水肿增厚,结膜上皮和固有层中可见大量炎性细胞浸润,肥大细胞弥漫,脱颗粒现象明显。与模型组及阴性对照组比较,七味舒敏方低剂量组、七味舒敏方中剂量组、七味舒敏方高剂量组及阳性药物对照组均可一定程度减轻结膜组织水肿,减少炎性细胞数量,减少肥大细胞脱颗粒,其中,七味舒敏方中剂量组、七味舒敏方高剂量组及阳性药物对照组改善较为明显。3.ELISA检测结果:与空白组相比,模型组及阴性对照组小鼠血清OVA-sIgE、https://www.selleck.cn/products/kd025-(slx-2119).htmlHIS、TNF-α及IL-4的表达水平显著增高,IFN-γ表达水平显著降低(P<0.05);与模型组及阴性对照组相比,阳性药物对照组及七味舒敏方各剂量组小鼠血清OVA-sIgE、HIS、TNF-α及IL-4的表达水平均有所降低,七味舒敏方高剂量组IFN-γ表达水平有所升高(P<0.05)。与阳性药物对照组相比,七味舒敏方高剂量组小鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4的表达水平无显著差异,无统计学意义(P>0.05),模型组与阴性对照组间小鼠血清OVA-sIgE、HIS、TNF-α、IL-4、IFN-γ表达水平均无显著差异(P>0.05)。4.Western Blot检测结果:各组间ERK蛋白相对表达无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,模型组、阴性对照组小鼠结膜组织中P-ERK蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,阳性药物对照组及七味舒敏方各剂量组小鼠结膜组织中P-ERK蛋白表达水平均有所降低(P<0.05);与阳性药物对照组比较,Panobinostat半抑制浓度P-ERK蛋白表达水平在七味舒敏方各剂量组小鼠结膜组织中的表达无统计学差异(P>0.05);中药低剂量组与中药高剂量组小鼠结膜组织P-ERK蛋白表达水平存在统计学差异(P<0.05);模型组与阴性对照组间小鼠结膜组织P-ERK蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。各组间JNK蛋白相对表达无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,模型组、阴性对照组、中药低剂量组、中药中剂量组小鼠结膜组织中P-JNK蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,中药高剂量组小鼠结膜组织中P-JNK蛋白表达水显著降低(P<0.05);与阳性药物对照组比较,P-JNK蛋白表达水平在中药高剂量组小鼠结膜组织中的表达显著下降(P<0.05);中药高剂量组与中药低剂量组、中药中剂量组相比,小鼠结膜组织P-JNK蛋白表达水平存在统计学差异(P<0.05);模型组与阴性对照组间小鼠结膜组织P-JNK蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。各组间P38蛋白相对表达无统计学意义(P>0.05);与空白组比较,各组小鼠结膜组织中P-P38蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,七味舒敏方低剂量组、七味舒敏方中剂量组小鼠结膜组织中P-P38蛋白表达水平有所降低(P<0.05),阴性对照组P-P38蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与阳性药物对照组比较,P-P38蛋白表达水平在七味舒敏方中剂量组小鼠结膜组织中的表达显著降低(P<0.05)。结论1.七味舒敏方可缓解AC模型小鼠过敏症状,减轻结膜损伤,保护结膜及眼睑形态结构,减少肥大细胞脱颗粒。2.七味舒敏方可抑制AC模型小鼠炎性因子HIS、OVA-IgE、IL-4、TNF-α的释放,促进IFN-γ表达,调节Th1/Th2平衡。3.七味舒敏方能够下调MAPK信号通路相关蛋白ERK、JNK磷酸化水平,其对AC模型小鼠的抗炎免疫效用可能与抑制MAPK/ERK/JNK通路激活导致的炎性反应相关。