植物寄生线虫给全球农业造成了巨大的经济损失,生物防治植物寄生线虫具有致死能力强、对环境友好等优点从而成为了植物寄生线虫防治的主流。前期研究发现,杀线虫芽胞杆菌B16(Bacillus nematocida B16)是一株具有显著杀线活性的芽胞杆菌,该菌株可以感知到线虫的存在,线虫产生的吗啉分子可诱导B16提前形成芽胞、在线虫肠道定殖从而杀死线虫。大量文献表明,代谢物作为一种信号分子,可调控细胞信号传导和表观遗传修饰,在细菌与线虫互作中起到至关重要的作用。B16对线虫的吸引能力要大于同为芽胞杆菌属的枯草芽胞杆菌168(Bacillus subtilis 168),这个过程挥发性物质起着非常重要的作用,那么两种芽胞杆菌的挥发性代谢物质有哪些差异?形成这些差异的原因究竟是转录水平还是代谢水平?当细菌感知到线虫后,两种芽胞杆菌又有哪些代谢差异?本研究以B16和168为研究对象,通过代谢组学分析两种芽胞杆菌的差异代谢物,借助q PCR、异源表达、同源模建、分子对接、酶学性质分析等方法探究两种芽胞杆菌差异代谢物形成关键酶的差异,分析关键酶的结构及活性差异,利用GC-MS检测线虫存在前后两种芽胞杆菌代谢物的差异从而解析不同芽胞杆菌差异感知线虫的分子机理,揭示代谢物作为“信号chronic otitis media分子”调控细菌芽胞形成的生理意义,为深入研究线虫和细菌互作关系奠定一定的理论基础。本研究的主要结果如下:1.B16和168的代谢组学分析。B16、168培养3天后,一共检测到9种差异代谢物,分别是:苄基甲基酮、2-十六酮、2-庚酮、苯乙醛、2-壬酮、5-甲基-2-己酮、N-二甲氨基甲基-叔丁基-异丙基膦、二氢-β-紫罗兰酮、2,2-二甲基-丙亚磺酰基砜。其中168中2-庚酮含量是B16的四倍。通过差异代谢物的化学纯品来测定它们与两种芽胞杆菌芽胞生成的影响,2-庚酮能够抑制两种芽胞杆菌芽胞的生成,2-庚酮(7.03mmol/m L)处理27小时时抑制率最大B16抑制率为74.6%,168抑制率为96%。通过趋化实验验证2-庚酮对于线虫的吸引能力,在稀释10倍(0.703 mmol/m L)时对线虫有吸引能力最强,趋化指数为0.45。结果说明了虽然同为芽胞杆菌属但是两种芽胞杆菌所产生的挥发性代谢KPT-330使用方法物仍有差异。2.两种芽胞杆菌硫酯酶Yne P差异分析。q PCR验证两种芽胞杆菌不同时间段yne P转录水平,结果表明培养12 h时,B16硫酯酶yne P基因的表达量是168的1.428倍;培养72小时时,B16硫酯酶yne P基因的表达量是168的0.991倍,它们的转录水平没有显著差异。生物信息学分析,两个酶氨基酸序列一致性达到97.12%,B16硫酯酶Yne P的分子量是15993.35 Da,等电点(p I)为7.06,168硫酯酶Yne P的分子量是16007.42 Da,等电点(p I)为7.82。都具有典型的TE(Thioesterase)结构域,含有保守的催化三联体Asp~(16)-His~(23)-Tyr~(26),起到终止反应和释放产物的功能。通过同源建模预测三级结构,两个硫酯酶Yne P三级结构呈现典型的“hot dog”结构,是TE超家族中最常见的结构折叠。两个酶存在4个差异氨基酸均不位于底物口袋和活性中心,位于单体B的第6位氨基酸由B16 Yne P的苏氨酸变为168 Yne P的赖氨酸,与单体C的第11位氨基酸精氨酸之间的距离产生较大变化,这可能导致A-B与C-D两平面的结合,影响硫酯酶四聚体形成。B16、168硫酯酶Yne P分别与代谢底物β-酮脂酰-Co A进行分子对接,结合能分别为-5.47(kcal/mol)、-6.95(kcal/mol)。结果说明了B16和168代谢物2-庚酮形成的转录水平没有显著差异且两个硫酯酶结构差异并不大。3.两种芽胞杆菌硫酯酶Yne P的异源表达纯化及酶学性质比较。利用PET-30a、PET-28a载体构建异源表达质粒并转化至BL21感受态细胞获得B16-PET30a-BL21、168-PET28a-BL21菌株。这两株菌的最佳诱导条件为0.2 mmol/L IPTG 16℃180 rpm诱导10 h,获得B16硫酯酶Yne P可溶性目的蛋白分子量大约为18 k Da,168硫酯酶Yne P可溶性目的蛋白分子量大约为17 k Da。对目的蛋白进行纯化,确定了500 mmol/L的咪唑浓度是两个重组目的蛋白的最佳洗脱浓度。进一步对重组酶酶学性质进行探究,B16、168硫酯酶Yne P酶活分别为1.243 U/m L、1.2339 U/m L。两个重组酶的最适温度均为30℃,最适p H分别为8、9,除了最适条件外,168 Yne P的相对酶活始终高于B16 Yne P的相对酶活,说明168 Yne P比B16 Yne P的耐受性更好,这可能是导致它们产生差异代谢物的原因。两个重组酶都在10℃～30℃、p H 7～8稳定性较好。4.两种芽胞杆菌感知线虫的差异。检测到在没有线虫存在的情况下B16有丁香酚的生成,而在感知线虫存在后丁香酚不再生成,说明线虫的存在抑制了B16丁香酚的生成。同为芽胞杆菌属的168在感知线虫前后均没有检测到丁香酚。根据文献报道,丁香酚能够抑制枯草芽胞杆菌168芽胞的生成。通过对不同时间段丁香酚纯品处理两种芽胞杆菌镜检后发现,丁香酚能够抑制两种芽胞杆菌芽胞的生成,在13小时时抑制了B16芽胞的生成,在14小时时抑制了168芽胞的生成。同时对芽胞抑制率进行统计,两种芽胞杆菌都在丁香酚(6.43 mmol/m L)处理24小时时抑制率最大,B16抑制率为27%,168抑制率为53%。综上所述,两种芽胞杆菌所产生的挥发性代谢物质存在差异,所产生的线虫引诱剂2-庚酮的差异并不是转录水平的。比较两种芽胞杆菌甲基酮合成关键酶Yne P后发现其结构、活性差异不大,但是168 Yne P温度、p H耐受性比B16 Yne P的更好,这可能是导致它们产生差异代谢物的原因。虽然168产生的2-庚酮多于B16,但是B16对于线虫的吸引能力要大于168。由此可见,细菌对于线虫的吸引并不是一FG-4592溶解度种挥发性代谢物的作用而是多种挥发性代谢物共同的作用。