第一部分HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变对HCC生物学功能的影响目的:探究HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变对HCC生物学功能的影响。方法:1.利用限制性内切酶,将野生型、G1896A和C2288A突变型HBV preC/C基因片段插入慢病毒表达载体p CDH,并将其转染进入293T细胞中构建重组慢病毒。2.将过表达preC/C基因的重组慢病毒分别感染Hep3B、HepG2、Huh-7及PLC/PRF/5四种HCC细胞,并通过嘌呤霉素筛选得到稳转细胞株。利用免疫印迹和免疫荧光检测HBcAg表达情况,利用ELISA检测HBeAg表达情况,验证细胞系。3.利用CCK8实验和克隆形成实验检测对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组HCC细胞的增殖能力。利用EdU掺入实验检测各组HCC细胞的DNA合成速率。4.通过Transwell实验比较对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组HCC细胞的侵袭能力。5.利用细胞划痕实验比较对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组HCC细胞的迁移能力。6.通过流式细胞术检测对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组HCC细胞的凋亡发生率。7.通过裸鼠肿瘤移植实验分析对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组HepG2细胞在体内生长成肿瘤的情况。8.通过检测细胞活力分析索拉非尼对对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组HCC细胞的抑制率。结果:1.经限制性内切酶和基因测序验证,野生型、G1896A和C2288A突变型HBV preC/C基因表达载体构建成功,重组慢病毒构建成功;2.经慢病毒感染和嘌呤霉素筛,分别成功构建Hep3B、HepG2、Huh-7及PLC/PRF/5四种HCC细胞对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组稳转细胞系,野生型组、G1896A和C2288A突变型组HCC细胞均表达HBcAg,野生型组和C2288A突变型组HCC细胞表达HBeAg,但G1896A突变型组HCC细胞不表达HBeAg;3.CCK8实验和克隆形成实验表明野生型组HCC细胞比对照组细胞增殖能力更强,形成克隆数目更多;G1896A和C2288A突变型组HCC细胞增殖能力显著高于野生型组,且形成克隆数目更多;野生型组HCC细胞中EdU阳性细胞比例显著高于对照组,G1896A和C2288A突变型组中EdU阳性细胞比例显著高于野生型组;4.Transwell实验表明野生型组HCC细胞比对照组细胞穿过细胞外基质的比例更高,G1896A和C2288A突变型组HCC细胞穿过细胞外基质的比例显著高于野生型组;5.细胞划痕实验表明野生型组HCC细胞比对照组细胞迁移速度更快,G1896A和C2288A突变型HCC细胞的迁移速度显著高于野生型组;6.流式细胞术结果表明野生型组HCC细胞比对照组细胞凋亡比例更低,G1896A和C2288A突变型HCC细胞凋亡比例显著低于野生型组;7.裸鼠肿瘤移植实验结果表明野生型组HepG2细胞比对照组细胞在体内长成肿瘤的体积更大,重量Acute respiratory infection更重;G1896A和C2288A突变型组HepG2细胞比野生型组细胞在体内长成肿瘤的体积更大,重量更重,肿瘤组织中HBcAg表达情况于体外一致,KI67在对照组、野生型组和突变型组HepG2细胞形成的肿瘤组织中的表达呈递增趋势;8.索拉非尼对对照组、野生型组和突变型组HepG2、Huh-7及PLC/PRF/5的抑制率呈递减趋势。结论:HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移,抑制HCC细胞凋亡,促进裸鼠体内肿瘤形成,并增强HCC细胞对索拉非尼的耐药性。第二部分HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变促进HBV复制目的:探究HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变对HBV复制的影响。方法:1.利用同源重组技术对野生型pCS-HBV1.3质粒preC/C基因G1896和C2288进行定点突变。2.通过将野生型与G1896A和C2288A突变型pCS-HBV1.3质粒转染HepG2和Huh-7细胞,构建HBV体外复制模型。质粒转染24 h、48 h和72 h后,收集各组细胞培养上清,用于检测HBeAg、HBsAg和HBV DNA,收集各组细胞用于检测HBV pg RNA。3.利用ELISA检测preC/C基因G1896A和C2288A突变对HepG2和Huh-7细胞上清中HBeAg和HBsAg表达的影响。4.通过qPCR检测preC/C基因G1896A和C2288A突变对HepG2和Huh-7细胞上清中HBV DNA的影响。5.利用RT-qPCR检测preC/C基因G1896A和C2288A突变对HepG2和Huh-7细胞内HBV pg RNA表达的影响。结果:1.成功构建preC/C基因G1896A和C2288A突变的pCS-HBV1.3质粒,并通过基因测序进行验证;2.成功建立野生型、G1896A和C2288A突变型HBV复制模型;3.preC/C基因G1896A突变使HBeAg无法表达,C2288A突变促进HBeAg表达。preC/C基因G1896A和C2288A突变均可以促进HBsAg表达,细胞上清中HBeAg和HBsAg在转染后表达呈时间依赖性增加;4.HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变均可以促进HBV DNA合成,且转染细胞上清液中HBV DNA在转染后呈时间依赖性增加;5.preC/C基因G1896A和C2288A突变均可以促进HBV pgRNA转录,细胞中HBV pg RNA的含量在转染后呈时间依赖性增加。结论:HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变促进HBV复制。第三部分HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变通过活化ERK/MAPK信号通路促进HCC进展目的:探究HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变促进HCC进展与ERK/MAPK信号通路的关系。方法:1.利用PCR阵列分析筛选G1896A和C2288A突变型组与野生型组HCC细胞中MAPK信号通路中差异表达的基因,并利用q RT-PCR对cmyc、BAX和BCL2在Hep3B、HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5细胞各自野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞中的表达进行验证。2.通过免疫印迹实验检测Hep3B、HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5细胞系各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞中p-ERK1/2、ERK1/2、p-MEK1/2、MEK1/2、c-myc、BAX和BCL2蛋白表达水平。3.利用免疫印迹实验检测ERK信号通路抑制剂PD 98059处理对HepG2和PLC/PRF/5细胞系各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞中p-ERK1/2、ERK1/2、p-MEK1/2、MEK1/2、c-myc、BAX和BCL2蛋白表达水平的影响。4.通过CCK8实验、克隆形成实验和EdU掺入实验检测PD 9805Gefitinib MW9对HepG2和PLC/PRF/5细胞系各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞增殖的影响。5.利用流式细胞术检测PD 98059对HepG2和PLC/PRF/5细胞系各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞凋亡水平的影响。结果:1.PCR阵列分析筛选和q RT-PCR发现,与野生型组HCC细胞相比,凋亡抑制基因c-myc和BCL2在突变型组HCC细胞中表达量升高,而凋亡促进基因BAX在突变型HCC组细胞中表达量降低;2.野生型组HCC细胞比对照组HCC细胞MEK1/2及ERK1/2磷酸化水平升高,c-myc和BCL2蛋白水平升高,BAX蛋白水平降低,G1896A和C2288A突变型组HCC细胞比野生型组HCC细胞MEK1/2及ERK1/2磷酸化水平升高,c-myc和BCL2蛋白水平升高,BAX蛋白水平降低;3.PD 98059可以显著抑制各组HepG2和PLC/PRF/5细胞中MEK1/2及ERK1/2磷酸化水平,c-myc和BCL2在PD 98059处理的各组HCC细胞中显著下调,BAX在PD 98059处理的各组HCC细胞中显著上调;4.PD 98059处理显著抑制G1896A和C2288A突变型组HCC细胞活力、克隆形成数量和EdU阳性细胞比例,对照组和野生型组HepG2和PLC/PRF/5细胞增殖无显著变化;5.PD 98059处理使得G1896A和C2288A突变型组细胞凋亡水平升高,对照组和野生型组HepG2和PLC/PRF/5细胞凋亡水平无显著变化。结论:HBV preC/C基因G1896A和C228PF-6463922 IC508A突变通过活化ERK/MAPK信号通路调控癌基因c-myc和细胞凋亡相关基因BAX和BCL2的表达,促进HCC细胞增殖,抑制HCC细胞凋亡。第四部分HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变通过内质网应激促进HCC进展目的:探究HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变促进HCC进展与内质网应激的关系。方法:1.利用转录组测序分析野生型组、G1896A和C2288A突变型组HepG2细胞中基因表达情况,筛选差异表达基因并进行富集分析。2.通过免疫印迹实验检测Hep3B、HepG2、Huh-7和PLC/PRF/5细胞各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞中BIP、pIRE1、XBP1、p-PERK、CHOP和ATF6蛋白表达水平。检测HCC细胞对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组的ROS生成情况。通过免疫荧光实验比较HepG2和PLC/PRF/5细胞对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组中HBcAg或HBeAg前体在内质网定位的情况。3.利用免疫印迹实验检测ERS抑制剂TUDCA处理对HepG2和PLC/PRF/5细胞系对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞中BIP、p-IRE1、XBP1、p-PERK、CHOP和ATF6蛋白表达水平的影响。4.通过CCK8实验、克隆形成实验和EdU掺入实验检测TUDCA处理对HepG2和PLC/PRF/5细胞系各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞增殖的影响。5.利用流式细胞术检测TUDCA对HepG2和PLC/PRF/5细胞系各自对照组、野生型组、G1896A和C2288A突变型组细胞凋亡水平的影响。结果:1.转录组测序结果提示,与野生型组细胞相比,G1896A和C2288A突变型组HepG2细胞中,内质网蛋白质加工信号通路中的基因表达上调;2.野生型组HCC细胞比对照组HCC细胞p-IRE1、XBP1、p-PERK和CHOP蛋白表达水平升高,BIP和ATF6无显著差异,G1896A和C2288A突变型组HCC细胞比野生型组HCC细胞BIP、p-IRE1、XBP1、p-PERK和CHOP水平升高,但ATF6水平无显著变化,G1896A和C2288A突变型组的HepG2和PLC/PRF/5细胞中ROS水平比野生型组细胞中显著升高,G1896A突变引起HBeAg前体的N端肽与BIP在内质网共定位水平增加,C2288A突变诱导细胞中BIP表达,且HBcAg和HBeAg与BIP共定位水平增加;3.TUDCA可以显著抑制各组HepG2和PLC/PRF/5细胞中IRE1及PERK磷酸化水平,BIP、XBP1和CHOP在TUDCA处理的各组HCC细胞中显著下调,ATF6水平无显著变化;4.TUDCA处理显著抑制G1896A和C2288A突变型组HCC细胞活力、克隆形成数量和EdU阳性细胞比例,对照组和野生型组HepG2和PLC/PRF/5细胞增殖无显著变化;5.TUDCA处理使得G1896A和C2288A突变型组细胞凋亡水平升高,对照组和野生型组HepG2和PLC/PRF/5细胞凋亡水平无显著变化。结论:HBV preC/C基因G1896A和C2288A突变通过诱导细胞内质网应激,促进HCC细胞增殖,抑制HCC细胞凋亡。