背景与目的牙周炎是一种发生于牙周组织的慢性感染性疾病,是世界第六大流行疾病,影响全球50%以上的成年人。牙周炎的发病机制复杂,涉及微生物挑战、宿主遗传变异和获得性环境压力等多种因素。在众多致病因素中,龈下菌斑中病原微生物的增加被广泛认为是牙周炎发生发展的必要先决条件。近年来,具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,Fnucleatum)作为牙周炎患者口腔内最常检测到的病原体之一,引起了人们的广泛关注,并被认为其与多种全身系统性疾病有着密切的联系。临床研究表明,F.nucleatum的检出率随着牙周炎病程的进展而增加。F.nucleatum是一种侵入性细菌,可以诱导多种宿主应答反应。研究证明,F.nucleatum可以侵入多种不同类型的宿主细胞并激活细胞内的的炎症级联反应。毒力蛋白是细菌发挥致病性的重要途径。F.nucleatum表达多种毒力因子以诱导各种宿主反应。例如,RadD和Fap2诱导淋巴细胞凋亡,FadA介导F.nucleatum对上皮细胞的黏附和侵袭。FadA目前被认为是具核梭杆菌最典型的毒力因子。据报道,F.nucleatum的毒力及致病性可能与FadA密切相关。研究发现,F.nucleatum与FadA的检出率均与牙龈指数成正相关,并且对于正畸患者牙龈炎症反应的发生和发展起着重要作用。FadA在F.nucleatum致病机制中的关键作用为探索Fnucleatum与牙周炎的关系提供了新思路。作为牙周膜中的重要细胞类型,牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)在维持牙周稳态中起着不可或缺的作用。随着牙周炎症的进展,口腔黏膜屏障受损,牙周菌群侵袭力的增加和宿主免疫反应的紊乱导致PDLSCs功能障碍。受损的PDLSCs会通过加剧宿主免疫反应、促进破骨细胞活动等来破坏牙周微环境。目前,人们对于PDLSCs在炎症环境中的详细生物学特性变化知之甚少,F.nucleatum对于PDLSCs生物学行为的影响尚未有明确报道。综上所述,本研究旨在探讨F.nucleatum在感染初期对PDLSCs生物学行为的影响及作用机制;进而明确F.nucleatum黏附素FadA对PDLSCs的毒性作用,并通过鉴定FadA在PDLSCs的互作蛋白揭示其致病分子机制;此外,通过时序性F.nucleatum与PDLSCs共培养后基因表达谱的变化揭示宿主细胞响应F.nucleatum感染的基因调控过程;最后,基于F.nucleatum作用机制筛选抵抗F.nucleatum感染、治疗PDLSCs炎症反应的药物,为临床治疗牙周炎提供新的思路。材料与方法1.具核梭杆菌对牙周膜干细胞生物学行为的影响F.nucleatum经复苏、扩大培养后,菌液经聚合酶链式反应实验后通过琼脂糖凝胶电泳实验及16S rRNA测序鉴定。牙周膜干细胞取自健康前磨牙或第三磨牙的牙周膜组织。利用成骨和成脂分化诱导评估其多向分化潜能。使用流式细胞仪进行表面标志物检测。将生长至对数期的F nucleatum与PDLSCs共培养,建立体外F.nucleatum感染模型。通过细胞计数法和乙炔基脱氧鸟苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)标签实验检测不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的F.nucleatum对 PDLSCs 增殖的影响。利用AnnexinV/FITC染色对F.nucleatum感染后不同时间点PDLSCs凋亡情况进行检测。使用FerroOrange探针检测F.nucleatum感染后PDLSCs胞内游离Fe2+的水平,使用JC-1探针检测F nucleatum感染后PDLSCs线粒体膜电位的变化情况,使用共聚焦显微镜进行观察,通过多标记微孔板检测系统对细胞内荧光强度进行定量分析。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantity real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测F.nucleatum感染后炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8在mRNA水平的表达情况,通过酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检测 IL-1β、IL-6、IL-8 在蛋白水平的表达。2.FadA 结合 PDLSCs 的 PEBP1 激活 PEBP1/IKK/NF-κB 和 PEBP1/Raf1/MAPK 信号级联反应诱导炎症因子表达通过大肠杆菌表达系统对带有His标签的重组FadA蛋白进行表达纯化。使用FadA刺激PDLSCs后,利用qRT-PCR及ELISA实验检测FadA对PDLSCs炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8表达的影响。使用His pull down实验获得PDLSCs中与FadA互相作用的蛋白,通过质谱对其鉴定,筛选到FadA在PDLSCs中的潜在互作蛋白PEBP1。利用免疫共沉淀实验对FadA与PEBP1在细胞内的结合情况进行验证。通过大肠杆菌表达系统获得纯化的带有His标签的PEBP1,使用表面等离子共振分析检测FadA与PEBP1的结合亲和力。利用蛋白免疫印迹实验(western blot)检测FadA刺激后PDLSCs的PEBP1、Raf1、IKK的磷酸化水平,并检测NF-κB、MAPK信号通路的激活情况。利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在 PDLSCs 中干扰 PEBP1 的表达,通过 qRT-PCR检测敲低效率。使用CFDA-SE染料标记的F.nucleatum感染PDLSCs,利用流式细胞仪检测PEBP1敲低后F.nucleatum对PDLSCs的侵袭能力。通过细菌黏附实验检测PEBP1敲低后F.nucleatum对PDLSCs的黏附能力。3.时间序列下具核梭杆菌刺激牙周膜干细胞后的RNA-seq分析用MOI=100的F.nucleatum感染PDLSCs,在感染后0h、1h、3h、6h、12h收集对照组和实验组的细胞进行RNA-seq测序分析。使用DESeq2对样本之间进行显著性差异分析,并筛选差异表达基因(different expression genes,DEGs)。使用pheatmap绘制热图将差异基因表达情况可视化。通过基因本体论(geneontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)进行基因功能富集分析。使用Pathview将信号通路的激活以及通路上相关基因的变化进行可视化展示。为了挖掘不同时间点的基因随时间变化表现出的潜在动力学特征,使用Mfuzz进行时间序列分析并对结果进行可视化展示。转录组数据使用bowtie2比对工具比对至人类参考基因组数据,并使用featureCounts获取microRNA表达量。使用DESeq2计算得到差异microRNA,利用miRWalk2.0预测靶基因。将差异表达基因数据经log2转化后进行kmeans聚类,并计算模块间和模块内的调控关系。使用TRRUST预测转录调控因子,将RegNetwork预测结果依据TRRUST结果过滤后得到相应的转录调控网络。4.基于具核梭杆菌作用机制的信号通路靶向药物筛选使用R软件包cogena进行共表达富集分析。通过GO富集分析对候选药物靶基因的生物学功能进行分析,利用SwissTargetPrediction数据库预测候选药物潜在的效应靶点,进一步筛选作用于IL-17、TNF、NF-κB、MAPK信号通路的靶向药物。通过CCK-8(cell countingkit-8)实验评估候选药物的细胞毒性,并确定用于后续研究的浓度。通过qRT-PCR和ELISA实验检测使用靶向药物阻断IL-17、TNF、NF-κB、MAPK信号通路后,对于F.nucleatum感染或FadA刺激引起的PDLSCs促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8表达的影响。使用FerroOrange探针和JC-1探针分别对细胞内游离Fe2+水平和线粒体膜电位进行检测。使用AutoDock Vina对靶向药物与其作用靶点进行分子对接模拟,并通过PyMOL进行可视化展示。通过western blot实验对候选药物piperlongumine的预测靶点进行验证。结果1.具核梭杆菌对牙周膜干细胞生物学行为的影响成功培养鉴定F.nucleatum;成功分离、培养并鉴定PDLSCs。细胞增殖实验显示,F.nucleatuw以时间和浓度依赖性的方式显著抑制PDLSCs的增殖,随着F.nucleatum浓度的增大,EdU阳性信号的比例逐渐减小,表明F.nucleatum可通过抑制细胞DNA复制来影响PDLSCsGW4869 MW的增殖能力。细胞凋亡实验发现,F.nucleatum的感染浓度越高,对PDLSCs凋亡的促进作用越明显。FerroOrange荧光探针染色的结果表明,F.nucleatun刺激后PDLSCs的Fe2+的荧光强度显著增加。通过使用JC-1荧光探针染色发现,F.nucleatum刺激后,PDLSCs中JC-1聚合物的荧光强度显著降低,JC-1单体:聚合物的比例增加,提示F.nucleatum诱导的细胞内不稳定铁水平的增加促进了 PDLSCs的线粒体膜电位去极化,损害了 PDLSCs的线粒体功能。qRT-PCR和Eselleck抑制剂LISA检测结果显示,F.nucleatum 感染显著刺激了 PDLSCs 中 IL-1β、IL-6、IL-8 的表达。2.FadA 结合 PDLSCs 的 PEBP1 激活 PEBP1/IKK/NF-κB 和 PEBP1/Raf1/MAPK 信号级联反应诱导炎症因子表达成功获得了带有His标签的重组FadA。FadA单独刺激即可引起PDLSCs的炎症反应,且炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8随时间变化的规律与F.nucleatum感染相一致。通过His pull down实验与质谱鉴定,我们发现磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)可以与FadA相互作用,并通过免疫共沉淀和表面等离子共振分析验证了 FadA与PEBP1的结合。Western blot的结果显示,FadA显著增加了 Raf1和IKK的磷酸化水平,ERK/JNK/p38和p65也在加入FadA后发生了磷酸化。使用siRNA抑制PEBP1表达后,经检测,敲低PEBP1的细胞内F nucleatum荧光强度显著降低,黏附的Fnucleatum菌落数也明显低于对照组。3.时间序列下具核梭杆菌刺激牙周膜干细胞后的RNA-seq分析主成分分析(PCA)结果表明,对照组基因表达呈现出较为稳定的状态,而F.nucleatum感染组随着感染时间的延长逐渐偏离正常细胞,同一时间点来源于不同个体的细胞表现出聚集的特征。通过DESeq2比较对照组和实验组1、3、6、12h的基因表达谱,每个时间点分别鉴定出25、271、495、619个差异表达基因。CXCL1、CXCL2、RASDJ和TNFAIP3在F.nucleatum刺激后的所有时间点均显著上调表达。通过Mfuzz分析将所有基因根据表达模式进行聚类,对照组聚类为30个簇,实验组聚类为20个簇,多种促炎性细胞因子被聚类到实验组的cluster 20中(如IL-1β、IL-6和IL-8),并随感染时间的延长其表达呈现逐渐增加的趋势。qRT-PCR实验对转录组分析结果进行了验证。基因功能分析的结果表明,PDLSCs应对F.nucleatum感染的反应在1 h内主要为宿主受体识别细菌表面抗原表位,然后在感染后12小时内逐渐激活宿主防御系统。另一方面,F.nucleatum可诱导PDLSCs发生炎症反应,这一过程与NF-κB信号通路的激活和炎症趋化因子的产生密切相关。通过对转录因子的预测,证明了 NF-κB1的关键调控作用,并揭示了F.nucleatum感染不同时间点的基因调控过程。4.基于具核梭杆菌作用机制的信号通路靶向药物筛选Cogena分析将F.nucleatum感染后所有的差异表达基因根据其表达模式分为了 3类,KEGG富集分析结果显示cluster 1和cluster 2中的基因在免疫与炎症相关通路中高度富集,而cluster3中的基因在钙信号通路和肌醇磷酸代谢中富集。结合药物靶基因的功能富集分析结果,我们选择了 6种信号通路靶向的药物。通过qRT-PCR检测炎症因子的表达,结果发现使用这6种药物阻断IL-17、TNF、NF-κB、MAPK信号通路后,均显著降低了F.nucleatum感染所诱导的IL-1β、IL-6和IL-8表达,荜茇酰胺和漆黄素表现出最好的抑炎效果,并可显著降低FadA诱导的促炎细胞因子的产生。FerroOrange和JC-1荧光探针染色的结果显示,荜茇酰胺和漆黄素逆转了由F.nucleatum所诱导的铁死亡,降低了细胞内Fe2+水平,恢复了受损的线粒体功能。通过分子对接模拟,结合western blot实验验证,结果表明,F.nucleatum感染增加了 IKK、p65和p38的磷酸化,而荜茇酰胺能显著阻断由F.nucleatum所诱导的IKK/p65/NF-κB和p38/MAPK信号通路的激活。结论1.本研究成功构建了体外具核梭杆菌-牙周膜干细胞共培养模型,证明了F.nucleatum可以抑制PDLSCs增殖,促进细胞凋亡、铁死亡和炎性细胞因子的产生。2.F.nucleatum黏附素FadA作为毒力因子,单独刺激可诱导PDLSCs中IL-1β、IL-6和IL-8的表达。进一步研究表明,FadA可与PDLSCs的PEBP1结合,激活Raf1/MAPK和IKK/NF-κB信号通路,诱导炎症反应。3.时序性转录组测序揭示了F.nucleatum感染Chemicals and Reagents后PDLSCs的基因表达谱,并明确了F.nucleatum所诱导的炎症反应与NF-κB信号通路的激活以及促炎性细胞因子的产生密切相关。4.荜茇酰胺、漆黄素、坦螺旋霉素、白桦脂酸、洛莫司汀、噻苯唑可以抑制.nucleatum感染导致的PDLSCs炎症反应,荜茇酰胺和漆黄素可抑制F.nucleatum诱导的铁死亡。荜茇酰胺通过阻断IKK/p65/NF-κB和p38/MAPK信号通路的激活发挥抗炎作用。