【研究背景】痒觉被定义为一种引起抓挠欲望的不愉快的感觉和情绪体验,而慢性痒可以引起皮肤的损伤并伴发焦虑、抑郁等情绪障碍,这些负性情绪又会进一步加剧瘙痒,形成恶性循环,严重影响患者的身心健康及生活质量。亟待开展高位中枢痒觉神经机制方面的深入研究,为慢性痒的临床治疗提供实验依据和新靶点。生长抑素(Somatostatin,SST)是一类神经肽,作为不同细胞功能的内源性抑制调节因子,参与发育、增殖、代谢、分泌和神经调节,有文章发现来源于背根节和脊髓背角神经元的SST阳性神经元主要表现出“促痒镇痛”的作用;条件剔除背根神经节和脊髓内的SST阳性神经元可致组胺(Histamine,His)、氯喹(Chloroquine,CQ)等致痒物质引起的搔抓次数明显降低,但脊髓上位中枢内SST神经元在痒觉信息传递中的作用目前尚不清楚。内侧前额叶皮层(Medial prefrontal cortex,mPFC)作为一个重要的高级脑功能区,在学习、决策和情绪等高级功能中发挥重要作用,也在疼痛调控及慢性痛伴发负性情绪中发挥重要作用。功能影像学研究发现瘙痒状态下,mPFC活动明显增强,但mPFC内SST阳性神经元在痒觉信息传递中的作用尚不清楚。本课题将运用SST Cre转基因小鼠,建立His、CQ诱发的急性痒模型以及卡泊三醇诱发的特应性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)慢性痒模型,并进一步结合光遗传学、化学遗传学、行为药理学和在体光纤记录等技术以mPFC为靶区,从细胞、突触、神经环路到整体行为多个层次出发,系统研究mPFC内SST阳性神经元在痒觉的作用和机制。【研究方法】1.在小鼠颈背部皮内注射His或CQ建立急性痒模型;在小鼠双侧耳部内外两侧分别涂抹卡泊三醇溶液,持续21 d建立特应性皮炎慢性痒模型,使用痒觉Adoptive T-cell immunotherapy视频跟踪系统检测小鼠的痒行为,计数小鼠30 min内的抓挠次数。2.运用旷场、高架十字迷宫技术检测特应性皮炎慢性痒小鼠的焦虑情绪。3.运用免疫荧光染色技术观察急性和慢性痒小鼠mPFC内FOS阳性细胞的分布;观察急性和慢性痒小鼠mPFC内SST神经元的激活情况。4.运用SST Cre转基因小鼠,结合脑立体定位注射技术,使mPFC内SST阳性神经元特异性表达GCa MP6s后,采用在体光纤记录方法观察瘙痒状态下mPFC内SST神经元钙信号的变化。5.运用SST Cre转基因小鼠,结合脑立体定位注射技术、化学遗传学和光遗传学技术,激活或抑制mPFC内SST阳性神经元,观察对痒行为的影响,研究mPFC内SST阳性神经元在痒觉的作用和机制。6.运用SST Cre转基因小鼠,通过脑立体定位技术将辅助病毒和RV-Env A-ΔGds Red注射到SST Cre小鼠mPFC内,观察其单突触传入联系;通过脑立体定位技术将DIO-EGFP病毒注射到SST Cre小鼠mPFC内,观察其传出联系。【实验结果】1.成功建立急性痒和慢性痒模型。皮内注射致痒剂之后,计数30 min内的搔抓次数。和对照组(11.83±7.02)次相比,His组抓挠次数为(91.33±14.00)次;CQ组抓挠次数为(138.16±12.38)次,模型组小鼠抓挠次数显著高于对照组。成功建立慢性痒模型,在第21天进行痒行为录像,计数小鼠30 min抓挠次数,和对照组(14.16±7.54)次相比;特应性皮炎慢性痒模型组小鼠30 min抓挠次数为(125.50±32.77)次,模型组小鼠抓挠次数显著高于对照组。2.对慢性痒小鼠进行旷场和高架十字迷宫行为学检测,旷场实验结果提示:和对照组相比,模型组小鼠在中央区停留的时间低于对照组小鼠。高架十字迷宫实验结果提示:和对照组相比,模型组小鼠在开放臂的停留时间低于对照组小鼠,提示慢性痒模型组小鼠存在焦虑样行为。3.运用免疫荧光染色技术观察急性痒模型小鼠mPFC内神经元激活情况,结果显示:与对照组相比,His和CQ模型组小鼠mPFC内FOS阳性细胞显著增加。特应性皮炎慢性痒模型小鼠mPFC内FOS阳性细胞数明显大于对照组。4.运用免疫荧光染色技术观察急性痒模型小鼠mPFC内SST阳性神经元的激活情况,结果发现:对照组mPFC内的SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(15.00±5.00)%;His诱发的急性痒模型mPFC内的SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(36.66±11.93)%;CQ诱发的急性痒模型mPFC内的SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(60.00±19.07)%,统计学结果表明模型组双标细胞所占比例显著增加。慢性痒模型组mPFC内的SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的https://www.selleck.cn/products/pexidartinib-plx3397.html(60.33±5.68)%,对照组SST/FOS双标神经元占SST阳性神经元的(15.33±5.50)%,与对照组相比,双标细胞所占比例显著增加。5.在体光纤记录结果表明在急性痒和慢性痒状态下,mPFC内SST阳性神经元钙信号上升。运用光遗传学技术,特异性激活mPFC内的SST阳性神经元,His诱发的搔抓次数降低,CQ诱发的搔抓次数增高;特异性抑制mPFC内SST阳性神经元,His诱发的痒敏感性增高,CQ诱发的痒敏感性降低。化学遗传学结果提示激活mPFC内的SST阳性神经元,慢性痒敏感性没有统计学差异;抑制mPFC内的SST阳性神经元,慢性痒敏Entinostat作用感性降低。6.利用逆行跨单突触示踪技术,观察到mPFC内SST阳性神经元的传入联系区域为:基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala,BLA)、丘脑中央外侧核(Central lateral nucleus,CL)、海马(Hippocampus,HIP)、岛叶皮质(Insular cortex,IC)、丘脑连接核(Thalamic nucleus reunions,Re)等;同时利用顺向病毒示踪技术,观察到mPFC内SST阳性神经元的传出联系区域为外侧僵核(Lateral habenula,LH)、中脑腹侧被盖区(Ventral tegmental area,VTA)等。【结论】急性痒和特应性皮炎慢性痒小鼠搔抓次数均显著增多,慢性痒小鼠存在焦虑样行为。急性痒和慢性痒模型小鼠mPFC内SST神经元激活在体光纤记录结果表明,在急性痒和慢性痒状态下,mPFC内SST神经元钙信号上升;光遗传学及化学遗传学结果提示mPFC内SST阳性神经元参与了痒觉信息的调控,mPFC内SST阳性神经元正向调控组胺非依赖性痒和特应性皮炎慢性痒;负向调控组胺依赖性痒。mPFC内SST阳性神经元在不同区域间的存在投射关系,为深入研究SST神经元在痒觉的环路机制提供了形态学依据。