一、研究背景胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是起源于肝内、门周或远端(肝外)胆道系统的恶性肿瘤,是目前第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤,仅次于肝细胞癌。按照解剖位置的不同,胆管癌可分为门周段胆管癌(perihilor cholangiocarcinoma,p CCA)、远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,d CCA)和肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,i CCA)。underlying medical conditions其中,肝内胆管癌是发生于二级及以上胆管分支上皮细胞的恶性肿瘤,在胆管癌中的比例为20%左右。近年来,我国肝内胆管癌的发病率在Bafilomycin A1逐年升高,并且因其发病较为隐匿,早期临床症状不典型,多数患者就诊时已经处于进展期或者晚期,预后极差。目前唯一可能治愈肝内胆管癌的方式是根治性手术切除,然而,由于肝内胆管癌在晚期时易发生局部浸润,并且可能存在腹膜转移甚至远处转移,或者受制于胆道重建选择等原因,可进行肿瘤手术的患者只有不到三成,且5年生存率仅约30%,术后复发率高达60%～70%。因此,探索肝内胆管癌发生发展的机制,寻找新的早期诊断标志物和治疗靶点对改善患者的预后具有十分重要的意义上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在某些特定的生理或者病理情况下,失去自身原有的上皮细胞特性转而获得间质细胞特性的生物学现象。EMT过程在个体发育、组织再生、伤口修复及器官纤维化等过程中起着重要作用。近年来研究发现,EMT参与了多种肿瘤的恶性进展过程,与肿瘤的发生、肿瘤干性、肿瘤耐药等密切相关,尤其是在肿瘤的浸润和转移过程中发挥了重要作用。因此,降低肿瘤细胞发生EMT对减少肿瘤转移,延缓肿瘤恶性进展有着重要意义。根据目前已有的研究显示,细胞的EMT过程受到多种因素的影响,其中去泛素化酶起到了复杂且重要的调控作用。泛素化修饰(Ubiquitination)是指在泛素激活酶E1,泛素转移酶E2以及泛素连接酶E3等一系列催化酶共同作用下,底物蛋白的残基被泛素修饰的过程,是经典的蛋白翻译后修饰方式之一。而蛋白质的泛素化修饰是一个可逆的过程,去泛素化酶(deubiquitinating enzyme,DUB)可以特异性地将泛素分子从底物蛋白上移除,使底物蛋白发生去泛素化。蛋白的泛素化和去泛素化的平衡是真核生物中蛋白质保持稳定和发挥功能的重要基础。去泛素化酶作为细胞中一种重要的调节因素,其结构的改变、表达的异常以及活性的失控与包括肿瘤在内的多种疾病有着密切关系。有研究表明,去泛素化酶卵巢肿瘤相关蛋白酶家族(the OTU-related proteases,OTUs)中的多种去泛素化酶在肺癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。而在本课题中,我们利用临床标本结合数据库分析,发现去泛素化酶OTUB2在肝内胆管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,并且其表达水平与肝内胆管癌患者的预后相关。进而通过一系列体外和体内实验证实了OTUB2可以影响肝内胆管癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。并通过深入探究揭示了去泛素化酶OTUB2通过与E3泛素连接酶TRAF6协同调节肝内胆管癌细胞中CTNNB1的蛋白水平,从而调控细胞中EMT驱动因子ZEB1的表达,最终影响肝内胆管癌的发生发展。二、研究目的1、探究去泛素化酶OTUB2在肝内胆管癌中的表达水平。2、分析OTUB2表达水平与肝内胆管癌患者的临床病理特征的关系。3、证实OTUB2表达水平对肝内胆管癌细胞的影响。4、阐释OTUB2影响肝内胆管癌恶性进展的分子机制。三、研究方法1、利用癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库对OTUB2在肝内胆管癌组织和癌旁组织中的表达差异进行分析。基于临床手术标本和组织芯片开展免疫组化实验和Western Blot等实验,并对结果进行深入分析验证OTUB2在肝内胆管癌中的表达水平以及其与患者临床病理特征的关系。2、利用慢病毒载体技术建立OTUB2敲低的人肝内胆管癌细胞系,使用Western blot实验、CCK-8实验、单细胞克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验以及流式凋亡检测等实验方法,验证OTUB2在体外对胆管癌细胞增殖凋亡,克隆形成以及迁移侵袭能力的影响。3、通过构建小鼠皮下移植瘤模型和肺转移模型探究OTUB2在实验动物体内对胆管癌细胞的影响。4、利用对照及OTUB2敲低的肝内胆管癌细胞株开展Western Blot、Transwell和划痕等实验并联合数据库分析探究OTUB2表达水平与细胞中EMT相关蛋白之间的关系。5、利用对照及OTUB2敲低的胆管癌细胞株开展染色质免疫沉淀、Western Blot、Transwell和划痕等实验以及数据库分析探究OTUB2表达水平与CTNNB1蛋白之间的关系。6、利用免疫共沉淀、Western Blot、q PCR等实验方法,阐明肝内胆管癌细胞中OTUB2促进CTNNB1蛋白表达的具体分子机制。四、研究结果1、分析来自癌症基因组图谱(TCGA)和基因型-组织表达(GTEx)数据库中的数据显示OTUB2在肝内胆管癌组织中表达升高并且其表达水平与患者总生存率相关。2、在临床手术取得的肝内胆管癌组织标本以及肝内胆管癌组织芯片中发现癌组织中的OTUB2表达水平与癌旁组织相比显著升高,并且其表达水平与肝内胆管癌的病理分级和临床M分期密切相关。3、OTUB2在体外可增强肝内胆管癌细胞的增殖和克隆形成,减少肝内胆管癌细胞凋亡,并促进肝内胆管癌细胞的迁移和侵袭。4、OTUB2在体内可以促进肝内胆管癌细胞的皮下移植肿瘤生长以及肺转移。5、OTUB2与肝内胆管癌细胞中EMT标志蛋白及EMT驱动因子ZEB1表达水平呈正相关,并且可通过调节ZEB1表达影响肝内胆管癌EMT进程从而促进肝内胆管癌细胞迁移和侵袭。6、OTUB2使肝内胆管癌细胞中的CTNNB1蛋白水平升高,并通过CTNNB1影响ZEB1表达,进而促进肝内胆管癌细胞迁移和侵袭。7、OTUB2通过抑制CTNNB1发生溶酶体自噬提高细胞中CTNNB1的蛋白水平。8、OTUB2与E3泛素连接酶TRAF6协同调节肝内胆管癌细胞中LC3泛素化水平,从而调控CTNNB1自噬。五、结论1、去泛素化酶OTUB2在肝内胆管癌中表达升高并且其表达水平与患者预后相关。2、OTUB2在体外和体内促进肝内胆管癌细胞生长、迁移和侵袭。3、OTUB2通过调节细胞中EMT驱动因子ZEB1的表达加速EMT进程从而促进肝内胆管癌细胞迁移和侵袭。4、OTUB2通过调控CTNNB1蛋白水平促进ZEB1表达。5、OTUB2与E3泛素连接酶www.selleck.cn/products/nvp-tnks656TRAF6通过调控LC3泛素化水平协同调节肝内胆管癌细胞中CTNNB1蛋白水平。