研究背景:核酸,包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),是几乎所有生命形式最重要的生物分子。DNA和RNA在生物的日常代谢活动中起着重要的作用:DNA储存了大量的遗传信息,RNA主要负责调控基因表达。除了基本生理功能外,DNA和RNA也可以用作疾病诊断、监测、个体化治疗以及预后评估的分析目标。切刻内切酶是可以特异性识别并附着特定的核酸底物序列(DNA或RNA),在其特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切刻的一类酶。在本研究中,我们将利用切刻内切酶这一独特的切割方式构建针对核酸靶标的新型生物传感器并探究其实际应用能力。设计具有任意形状和可控运动纳米结构的能力使DNA纳米材料广泛用于构建具有不同结构和功能的各种分子机器,其中DNA walker以其巧妙的设计和灵活的功能成为最受欢迎的分子器件之一。DNA walker可在多维度轨道上渐进自主移动,在生物传感、材料组装与合成、疾病诊断等方面具有广泛的应用前景。在过去几年中,DNA walker从结构设计到生物应用取得了惊人的进展,但其可持续性与速度限制仍然制约着其进一步应用。在本研究中,我们设计了一种切刻内切酶驱动的三维lame DNA walker。这种DNA walker简单、灵巧,增加可持续性的同时保证其高效地自主运动,大幅度提高了以lame DNA walker作为生物传感检测的稳定性及检测速度。恒温指数扩增技术,如指数放大反应(Exponential Amplification Reaction,EXPAR)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)、环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种仅需在恒定温度下就可实现以指数形式扩增核酸靶标的方法。与广泛使用的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相比,等温指数扩增技术无需精确的热循环,因此在便携式检测领域有着极强的吸引力。此外,分析微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA)靶标时,mi RNA的短长度(通常20个碱基左右)使得PCR设计非常复杂。在众多检测mi RNA的等温指数扩增技术中,EXPAR因设计简单,迅速放大能力强而受到广泛关注。然而,EXPAR对于微量mi RNA的检测应用依然受到模板序列依赖的掣肘。为了解决这个问题,本研究充分利用EXPAR扩增系统中原有的切刻内切酶成分,以熵驱动元件作为mi RNA靶标的识别元件,从而构建了一种基于切刻内切酶的熵驱动反应启动EXPAR的mi RNA通用、特异检测方法。除如Nb.Bbv CI这种常规的切刻内切酶外,近年来用于基因编辑的切刻内切酶也引起了研究人员的广泛关注。寻找可能有助于基因编辑的酶研究最近将注意力集中在来自原核生物的Argonaute蛋白(Prokaryotic Argonaute proteins,p Agos)。虽然它们是人类Argonaute蛋白的结构同源物,后者使用RNA引导来干扰RNA靶标,但Pf Ago,Tt Ago,Mj Ago等p Agos可使用单链DNA引导来识别并切割互补的DNA或RNA靶标,达到类似常规切刻内切酶的效果。大量证据表明,检测液体活检中循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ct DNA)中的单核苷酸变异体对于癌症的早期检测或最小残留疾病监测具有独特的益处,但目前临床的ct DNA检测依然面临耗时、操作繁琐以及成本高昂的问题。在本研究中,我们利用新型的Tt Ago基因编辑切刻内切酶偶联EXPAR反应,实现了ct DNA的超迅速、简单、灵敏检测。虽然基于CRISPR-Cas系统(Clustered Regularly Interspaced PalindrGW4869供应商omic Repeats/CRISPR-associated Proteins System)的检测方法已经彻底改变了诊断领域,但其因受到PAM或前间隔区侧翼位点(Protospacer Flanking Sites,PFS)的限制以及需要不易保存的RNA作为引导核酸而面临挑战。类似于CRISPR-Cas,p Agos蛋白由于其识别和切割靶序列的能力,已经被提议作为有前途的下一代核酸检测平台,因此p Agos可作为解决CRISPR-Cas所面临挑战的一种很有吸引力的工具酶。但目前已报道基于p Agos的核酸检测平台或与PPI3K/Akt/mTOR抑制剂CR相偶联,或与后续的恒温扩增步骤分离开来,导致难以在恒定温度下一步检测核酸靶标。在本研究中,我们利用Tt Ago蛋白整合高温EXPAR反应,实现了于66°C条件下一步检测任意感兴趣RNA靶标的超灵敏特异检测方法。研究目的:常规切刻内切酶部分:(1)构建切刻内切酶驱动的三维lame DNA walker,增加可持续性的同时保证其高效地自主运动,大幅度提高其作为生物传感检测的稳定性及检测速度。(2)构建一种基于切刻内切酶的熵驱动反应启动EXPAR的mi RNA通用、特异检测方法。新型Argonaute基因编辑切刻内切酶部分:(1)Tt Ago切刻内切酶偶联EXPAR反应,实现循环肿瘤DNA的超迅速、简单、灵敏分析。(2)Tt Ago整合热稳定EXPAR反应构建恒温扩增体系,一步高灵敏、特异检测任意感兴趣RNA靶标。研究方法:1.切刻内切酶启动的lame DNA walker分子机器的构建(1)扫描电镜表征链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球。(2)荧光终点检测证明8个栓子以及14个栓子的lame DNA walker可行性。(3)荧光动力学比较研究单腿DNA walker以及双腿的lame DNA walker。(4)荧光终点检测以及荧光显微镜研究lame DNA walker的可持续性(5)lame DNA walker的性能优化研究。(6)探究lame DNA walker检测单链靶标的灵敏度与特异性。2.切刻内切酶辅助熵驱动元件触发指数扩增反应的一步恒温扩增策略用于micro RNA特异和超灵敏检测研究(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光动力学证明切刻内切酶辅助熵驱动元件的可行性。(2)切刻内切酶辅助熵驱动元件产物触发EXPAR反应可行性研究。(3)切刻内切酶辅助熵驱动元件触发指数扩增反应恒温扩增策略(NAED-EXPAR)可行性研究。(4)NAED-EXPAR的实验条件优化。(5)mi R-21靶标用于标准的EXPAR方法检测。(6)mi R-21靶标用于NAED-EXPAR策略的灵敏度及其特异性分析。(7)NAED-EXPAR与荧光定量PCR(RT-q PCR)分析各细胞系样本mi R-21靶标的性能比较研究。3.Argonaute内切酶偶联指数扩增的循环肿瘤DNA超迅速分析研究(1)Tt Ago基因编辑切刻内切酶的表达、纯化与表征。(2)Tt Ago在不同缓冲溶液中的切割活性研究。(3)Mg~(2+)、SSB以及d NTP浓度对Tt Ago切割活性影响。(4)EXPAR的灵敏度测试。(5)Thermus thermophilus Argonaute偶联指数放大(Tt Ago-CEAR)的实验条件优化。(6)Tt Ago-CEAR的灵敏度与特异性分析。(7)纳米粒子探针的合成。(8)基于太赫兹光谱或横向流试纸条的Tt Ago偶联传感检测ct DNA研究。(9)Tt Ago-CEAR检测不同突变分数ct DNA。(10)Tt Ago-CEAR与ARMS PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR)检测血浆样本的比较研究。(11)小鼠实验验证Tt Ago-CEAR检测肿瘤负担以及监测治疗状况潜能。4.基于Argonaute内切酶的RNA恒温检测平台构建及应用研究(1)PAGE电泳证明Tt Ago酶在65至69°C条件下特异性切割单链RNA的能力。(2)荧光动力学分析Tt Ago酶在65°C条件下特异性切割单链RNA能力。(3)荧光动力学分析各DNA聚合酶与切刻内切酶组合的热稳定EXPAR性能。(4)PAGE电泳以及荧光动力学证明基于Thermus thermophilus Argonaute的恒温扩增(Tt Ago EAR)策略的可行性。(5)Tt Ago EAR策略的实验条件优化。(6)Tt Ago EAR策略的灵敏度测试。(7)Tt Ago EAR与RT-q PCR方法的比较性研究。(8)细Ethnoveterinary medicine胞与组织内RNA以及唾液中病毒RNA的Tt Ago EAR分析。(9)Tt Ago EAR联合横向流试纸条的便携传感分析。研究结果:1.切刻内切酶驱动的三维lame DNA walker在30分钟内显示出60.4的信噪比;动力学研究表明,瘸腿步行器的平均速度可达6.467×10~(-11) M s~(-1);14个碱基的栓子可以使lame核酸催化剂与运动轨道持续保持联系;lame DNA walker的线性检测范围为10p M-5 n M。2.针对mi R-21靶标,标准的EXPAR方法仅能明显检测10 p M的目标物,而NAED-EXPAR可以于60分钟内检测100 a M的目标物;NAED-EXPAR可以识别单个核苷酸变异的mi RNA靶标;NAED-EXPAR检测细胞内mi R-21靶标的RSD(Relative Standard Deviation)值可控制于15%以内,与RT-q PCR两方法线性回归分析的R~2值为0.994。3.动力学研究表明Tt Ago在TMSN缓冲溶液(Thermo Pol+Mg~(2+)+SSB+d NTPs)中的ct DNA靶标切割半衰期为2分钟;PAGE研究证明Tt Ago可以于5分钟内在TMSN缓冲溶液中快速切割野生型G12D靶标;Tt Ago-CEAR可以在16分钟内检测低至25 a M的KRAS(Kirsten Rats Arcomaviral Oncogene Homolog)常见突变型G12D靶标,线性检测范围为25 a M-2.5 p M;检测同浓度G12D靶标时,可以不受野生型KRAS,EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor),NRAS(Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog)等基因干扰;Tt Ago-CEAR也可以灵敏检测G12V,G12R,G12A,G12S,G12C,G13D六种其他常见的KRAS突变;Tt Ago偶联太赫兹平台检测灵敏度为2.5 a M,便携横向试纸条检测灵敏度为80 a M,均可于20分钟实现ct DNA的快速分析;输入25 f M的总ct DNA,Tt Ago-CEAR可以检测0.3%-100%突变分数的G12D,检测灵敏度低至0.1%;来自Horizon Discovery的血浆样本表明Tt Ago-CEAR的ROC(Receiver Operator Characteristic)准确性(95%)高于常见的ARMS PCR方法(93%);动物实验表明盐水处理组小鼠血浆G12D ct DNA水平与肿瘤体积上升节律一致,吉西他滨化疗组小鼠血浆在18天前G12D ct DNA水平上升幅度明显低于未接受治疗的盐水处理组。4.Tt Ago酶可以在65-69°C条件下特异性识别并切割突变型RNA靶标而不切割野生型RNA;Bst 3.0 DNA聚合酶与Nb.Bts I联合Tt Ago可以实现1 p M靶标RNA检测,其检测阈值与空白样本差异可达65.80±0.99分钟;Tt Ago可以明显影响Tt Ago EAR的分析性能;Tt Ago EAR的检测灵敏度为10 a M-50 a M,其检测结果与RT-q PCR方法检测结果一致性高,回归系数为0.993;相比阴性对照样本,Tt Ago EAR能够明显区分细胞、组织以及唾液样本中的阳性RNA靶标;Tt Ago EAR可以利用2 ng的总RNA材料检测细胞样本中低至0.1%的G12D RNA突变;Tt Ago EAR检测的小鼠血浆G12D RNA水平与小鼠肿瘤负荷状况一致;Tt Ago EAR联合横向流试纸条可以便携式检测浓度低至20a M-50 a M的RNA靶标。研究结论:1.与大多数双腿DNA walker的结构不同,lame DNA walker有一条主要负责持续运动的长腿和一条快速切割基质的短腿。这种切刻内切酶驱动的lame DNA walker运行速度快,同时显示出高信噪比,这些性能均比已报道的三维DNA walker明显更具优势。lame DNA walker持续性研究证实了lame核酸催化剂不会脱离运动轨道。此外,提出的瘸腿步行器显示出高灵敏度和特异性的传感检测潜力。这项工作将进一步提高三维DNA walker的性能,并有助于加深对DNA walker系统的理解。2.针对mi R-21靶标,NAED-EXPAR相比标准EXPAR方法检测灵敏度至少高5个数量级,同时具有特异性进一步提升,大幅度提高了检测性能。实际样本表明NAED-EXPAR与RT-q PCR检测结果一致,证明建议方法检测的可靠性。此外,NAED-EXPAR通过一步恒温策略的单管测试增加了检测简便性。目前的研究有助于监测细胞内mi RNA水平和辅助早期癌症诊断。3.TMSN缓冲溶液作为Tt Ago-CEAR的最佳反应缓冲液。构建的方法可以以阿摩灵敏度以及单核苷酸分辨率超迅速分析ct DNA靶标,与常见的ARMS PCR和数字PCR的1-2小时时间相比,Tt Ago-CEAR方法显著缩短了可靠的ct DNA检测所需的时间。鉴于其不需要PAM的较短引导核酸DNA需求,其在检测ct DNA的设计上也非常简单。此外,这种策略还具有监测肿瘤负荷和评估化疗效果的巨大潜力。4.Tt Ago EAR是一种真正的恒温检测方法,其可以于66°C条件下以阿摩灵敏度以及单核苷酸分辨率一步检测RNA靶标。Tt Ago EAR的顺利进行还依赖于Tt Ago的高保真性:除了切割RNA靶标外,Tt Ago还具有促进Tt Ago EAR反应和抑制其非特异性扩增的能力。这也是首次发现Tt Ago作为反应增强剂的例子。Tt Ago EAR能够传感检测不同类型的RNA,包括三种lnc RNAs、一种病毒RNA和一种m RNA,证明Tt Ago切割和热稳定EXPAR偶联的Tt Ago EAR方法的优越性。此外,Tt Ago EAR联合横向流试纸条检测有助于RNA靶标的便携式分析。