目的:基于先证者-双亲小家系的全基因组测序分析筛选出可疑的致病基因变异,使用斑马鱼模式动物平台对目标基因变异的功能进行验证研究。方法:招募纳入11个双侧小耳畸形患儿及其耳廓表型正常的生物学父母,进行全基因组测序分析,原始数据经过质量控制、序列比对、基因注释,采取家系共分离分析策略筛选得到可疑的致病基因变异。参考斑马鱼胚胎空间转录组数据和原位杂交试验,明确目标基因的时间空间表达谱。运用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑,在斑马鱼胚胎中敲除目标基因,观察斑马鱼胚胎第一、第二咽弓发育表型。运用软骨阿尔新蓝染色和软骨细胞膜免疫荧光染色探索斑马鱼颌面软骨发育情况。运用PHH3和TUNEL免疫荧光染色评估早期斑马鱼胚胎细胞的增殖活动和凋亡活动。选用经典的标记基因制作探针,在野生型斑马鱼和突变体斑马鱼中进行原位杂交,明确目标基因功能障碍对颌面软骨发育分化过程重要节点中的影响。结果:11个家系中9位先证者为男性患儿,2位先证者为女性患儿。通过全基因组测序,获得了总大小5.92Tb的高质量原始数据。以家系为单位平行比对并联合分析,各个家系新发的罕见https://www.selleck.cn/products/rsl3.html变异数目在299～346之间,符合家系共分离的变异基因数在25～44之间。排除了同义变异和内含子变异之后,有3个基因在至少两个家系中重复出现。选择Trichostatin A供应商在3号、5号和6号家系中出现变异的微管蛋白折叠辅助因子E(TBCE)基因为目标基因做后续功能研究。斑马鱼同源基因tbce在斑马鱼胚胎早期持续表达,并在咽弓区域表达。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除tbce,阿尔新蓝软骨染色和软骨细胞膜免疫荧光染色显示突变体胚胎咽弓区域软骨发育异常,细胞排列紊乱。tbce功能缺失抑制了咽弓区域神经嵴细胞的增殖活动并促进了凋亡活动。斑马鱼胚胎中,tbce功能缺失不影响咽囊的形成,不影响神经嵴细胞的形成和迁移,但阻碍了神经嵴细胞的软骨分化过程。结论:TBCE基因的变异可能是人类双侧小耳畸形的致病local and systemic biomolecule delivery基因之一。斑马鱼早期胚胎中,tbce功能障碍通过干扰神经嵴细胞的增殖-凋亡平衡和阻碍软骨分化而造成颌面软骨的发育畸形。