《中国心血管病报告2020》显示,我国心血管病患病率及死亡率不断攀升,已经成为夺走国人性命的头号杀手,临床运用经皮冠脉介入术(percutaneous c oron-ary intervention,PCI)和药物溶栓等再灌注疗法改善心肌缺血造成的不可逆心肌损伤疗效显著。但真实世界研究表明,再灌注治疗是一把双刃剑,再灌注后缺血区心肌在血流重新供应后会加重心肌损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI),其后期导致的心力衰竭及相关并发症、病死率不断攀升,寻找有效干预MIRI损伤的方法为亟待解决的临床难题。基础实验研究表明,心肌缺血再灌注损伤是多种复杂经典机制共同调控的疾病发生过程,其中炎症是心脏缺血再灌注损伤过程中最早出现的反应之一,细胞坏死是心肌缺血再灌注损伤中的经典途径,两者互为因果、相互伴行。铁死亡是依赖铁离子积累及脂质过氧化发生的调节性死亡,其关键影响脂肪酸代谢,酰基辅酶 a 合成酶长链家族成员 4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)是一种参与脂肪酸代谢的酶,研究证明其为铁死亡的特殊生物标志物,其过表达会导致铁死亡。细胞死亡后释放损伤相关分子模式,干预TLR4表达进而激活转录因子NF-κB,诱发免疫炎症反应加剧心肌损伤。心肌缺血再灌注损伤中铁死亡与免疫炎症反应密切相关,但可能的协同作用机制并不明确。导师基于多年的临床实践认为:冠心病进展的病机关键为“热结血脉”,即“热邪”与血脉中的“瘀血痰湿”等有形之物相互搏结,治疗当以清热解毒、活血散结,并据此创研代表方剂金玄安脉(别名:HJ11)。医家认为中医热的概念包括西医炎症反应,“热结血脉”的生物学基础可能与心脑血管中发生的炎症过程密切相关。为探求“热结血脉”的生物学基础及HJ11治疗缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)心肌损伤的可能作用机制,本研究拟从免疫炎症反应、铁死亡及两者作用关系展开实验,以期为冠心病的临床诊疗提供新的思路。研究目的1.明确临床效验方HJ11治疗冠心病的疗效,通过制备大鼠缺血再灌注模型,使用HJ11方进行干预,考察HJ11对缺血再灌注模型大鼠血清学指标及病理学的影响。2.明确HJ11方改善大鼠缺血再灌注心肌损伤的可能作用机制,探索HJ11对铁死亡及免疫炎症反应的影响。研究方法1.采用心动超声、ELISA检测血清学指标及组织染色观察HJ11对于I/R大鼠心肌损伤的改善作用。制备SD大鼠心脏缺血再灌注模型,心动通过超声的射血分数及室壁运动指标、心肌酶LDH、CK-MB作为模型评估指标,通过组织染色观察心肌形态结构改变、TTC观察心肌白色梗死面积、Tunel染色观察I/R大鼠心肌改变。2.采用ELISA及流式分选检测炎症因子的表达、相关免疫细胞亚型的比例,以明确HJ11对于I/R大鼠炎症反应的调节作用。利用ELISA检测I/R大鼠心脏组织匀浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,通过流式细胞术检测大鼠血清中性粒、单核细胞各亚型的比例。3.采用ELISA、组织染色、透射电镜及蛋白免疫印迹实验明确HJ11对于I/R大鼠铁死亡的干预作用。通过ELISA法检测大鼠血清及心脏组织中亚铁离子的表达;采用普鲁士蓝染色检测心脏组织中铁离子的沉积;通过透射电镜观察心肌组织中线粒体的结构改变,通过蛋白免疫印迹实验检测铁死亡相关蛋白的表达。4.采用小干扰RNA技术及转染过表达质粒方法探索HJ11对于改善I/R大鼠心肌损伤的可能作用机制。制备H9c2缺血再灌注的细胞(OGCR)模型,通过转染小干扰RNA及过表达质粒干扰H9c2细胞中ACSL4的表达。通过EL ISA观察细胞培养上清中炎症因子的表达,通过激光共聚焦观察转录因子NF-κB的核转移情况,通过蛋白免疫印迹法检测心肌细胞中TLR4/MyD88/NFκB及其下游信号分子的表达。研究结果1.HJ11可改善I/R大鼠心肌损伤。心动超声可见I/R组左心室射血分数降低至30.67±5.55%,使用Aspirin、HJ11干预后可见射血分数增加,Aspirin组射血分数增加至47.77±10.28%,中、高剂量组较低剂量组改善效果更为明显,高剂量组射血分数增加至45.23±5.03%(p<0.05),有效改善了大鼠心脏缺血再灌注后的心脏功能;心肌酶指标结果显示,I/R组较Sham组大鼠血清中LDH、CK-MB表达增加,使用HJ11干预后可降低大鼠缺血再灌注后LDH、CK-B的表达且同阳性对照药Aspirin组效果无异;TTC染色结果显示I/R组较假手术组的白色梗死面积增AM-2282使用方法加,为43.74±27.19%(p<0.05),Aspirin、HJ11干预后可见明显的白色梗死面积减少,其中HJ11-H组的效果最为明显,可见白色梗死面积减少至23.85±0.02%,说明HJ11可减少大鼠心肌缺血再灌注后造成的心肌梗死面积(p<0.05);本部分结果表明模型制备成功且HJ11干预效果和Aspirin干预效果一致。HE结果可见HJ11可改善I/R大鼠的心肌组织结构改变并减少炎性细胞浸润;TUNEL染色结果显示I/R组较假手术组凋亡细胞明显增多,I/R组凋亡细胞阳性率高达53.86±6.78%,使用HJ11干预后可见凋亡细胞减少,HJ11-H组改善效果最为明显,阳性细胞率可降低至18.4-4±5.17%(P<0.01),说明HJ11可减轻大鼠缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。2.HJ11可减轻I/R大鼠炎症反应。ELISA检测结果显示,I/R组各炎症因子较假手术组TNF-α、IL-6、IL-1β表达增加2-3倍,其中I/R组心脏组织TNF-α的表达高达 99.11±5.53、IL-6 为 64.60±5.30、IL-1β为 81.75±10.58,使用 HJ11干预可降低大鼠心肌组织匀浆中炎症因子的表达,且呈现剂量依赖性下调,HJ11-H组较I/R组炎症因子TNF-α的表达降低,TNF-α降低为56.19±16.58(P<0.01)、IL-6 为 38.58±9.37、IL-1β为 33.64±8.51(P<0.01),说明 HJ11可有效降低各炎症因子的表达(P<0.01);流式细胞术检测结果显示,HJ11对大鼠I/RI/R的中性粒细胞及单核细胞的调节呈现不同的趋势,I/R组较假手术组可见中性粒细胞表达增加(P<0.01);单核细胞总比率表达降低,其中I/R组较假手术组的单核细胞促炎症亚型表达增加(P<0.05)、抑炎症表型表达降低(P<0.05)。ELISA及流式细胞分选结果说明HJ11对于大鼠心脏缺血再灌注后的炎症反应有很好的抑制作用;透视电镜观察心肌细胞细微结构,可见HJ11可改善大鼠心肌缺血再灌注损伤后的线粒体结构,减轻线粒体收缩、线粒体嵴断裂。3.HJ11可干预I/R大鼠铁死亡。ROS结果示,I/R组较假手术组ROS表达增加,I/R组ROS表达可至145.3±5.86,是假手术组表达量47.00±4.00的3倍(P<0.01),HJ11干预后可见ROS降低,HJ11-此网站H组效果更为显著,可降低至102.70±5.69(P<0.01),说明HJ11可明显降低ROS的积累。MDA及SOD结果可见,HJ11可降低大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌组织中MDA的表达,增加大鼠心肌组织SOD及GSH的表达(P<0.05);ELISA检测大鼠血清及心肌组织中亚铁离子的表达,I/R组较假手术组呈现明显的增加,HJ11可呈剂量依赖性的抑制铁离子的沉积(P<0.01),普鲁士蓝染色结果也可见I/R组较正常组蓝染铁离子增加,HJ11干预后可见蓝染面积减少(P<0.05);Western blot检测大鼠心肌组织中铁死亡关键蛋白的表达,发现HJ11可下调ACSL4、COX2的表达,增加GPX4、FTH-1的蛋白表达。4.HJ11对于改善I/R大鼠心肌损伤的可能作用机制。H9c2大鼠心肌细胞系重复体内研究的结果,发现HJ11可有效降低H9c2细胞OGD/R后的氧化应激损伤,并且可以呈现剂量依赖性的减少铁离子的沉积,活性氧的累积,提高H9c2细胞活力,改善OGD/R后biopolymer gels的心肌损伤;ATP及mtDNA结果可说明,HJ11可以影响心肌细胞的能量代谢,增加ATP、mtDNA含量(P<0.05);透视电镜进一步观察H9c2细胞细微结构可见,HJ11也可改善OGD/R造成的线粒体的结构损伤,减轻线粒体收缩;Western blot结果可见HJ11可上调铁死亡关键蛋白GPX4、FTH-1的蛋白表达(P<0.05),降低ACSL4、COX2的表达(P<0.05),在心肌细胞OGD/R损伤中HJ11依然可发挥抑制铁死亡的作用;在OGD/R处理的H9c2细胞中ACSL4的敲除减轻了铁的积累、氧化应激和铁死亡;通过转染过表达ACSL4质粒逆转了 HJ11对OGD/R触发的铁沉积的抑制作用;增加了铁死亡诱导剂及抑制剂组,结果发现HJ11可发挥和铁死亡抑制剂效率相近的抑炎效果,并且观察加入铁死亡诱导剂组,炎症因子较HJ11组明显上调(P<0.05);共聚焦结果可见OGD/R组胞核内较胞浆内的NF-κB增加,使用HJ11干预后可逆转NF-κB入核增多的现象;蛋白免疫印迹实验结果可见OGD/R组较正常组TLR4、MyD88及TRAF6蛋白表达上调,胞浆内NF-κB减少,胞核内NF-κB增加,并且伴随P65的磷酸化增加(P<0.05),P-P65表达上调;IKBα表达未有明显变化,但是磷酸化的IKBα上调明显(P<0.05);使用HJ11干预后可见TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表达较OGD/R组降低,胞浆内NF-κB增加,胞核内NF-κB降低,并且伴随P65的磷酸化减少(P<0.05),P-P65表达下调;IKBα表达未有明显变化,但是磷酸化的IKBα减少明显(P<0.05)。加入铁死亡诱导剂Eartin后可逆转HJ11对上述蛋白表达的影响,而HJ11干预组和铁死亡抑制剂组Fer-1对于蛋白表达调控的作用基本相同,说明HJ11可发挥铁死亡抑制剂效果,通过降低转录因子NF-κB的激活、调节TLR4/MyD88/NFκB信号通路蛋白表达发挥减轻炎症反应的作用。研究结论1 HJ11可减轻大鼠心肌缺血再灌注造成的心肌细胞病理损伤、改善缺血再灌注损伤后的心肌功能、减少心肌梗死面积的扩大,并降低心肌细胞凋亡;2 HJ11可减轻心肌缺血再灌注后的炎症因子的释放,并降低中性粒细胞、单核细胞促炎症表型的比例,改善炎症反应带来的心肌损伤;3 HJ11方减少I/R损伤后的铁离子沉积,减轻铁死亡,改善缺血再灌注造成的氧化应激损伤;4HJ11发挥铁死亡抑制剂的作用调控铁死亡关键蛋白ACSL4的表达干预铁死亡的发生发展,并且可以调节炎症反应关键信号通路TLR4/MyD88/NF-κB的表达变化,降低心肌细胞缺血再灌注损伤中的炎症因子的释放,降低炎症反应带来的心肌损伤,总之,HJ11可通过调节ACSL4介导的铁死亡及TLR4/MyD88/NF-κB 抑制心肌 I/R 损伤。