山药(Dioscorea opposita Thunb.)的块茎含有丰富的营养物质,不仅药食两用,还可用作工业原料和饲料,是广泛分布于非洲、亚洲、大洋洲和南美洲等地的重要薯类作物之一,也是我国重要的经济类作物。山药块茎中淀粉是最重要的营养成分,淀粉含量的高低直接影响了山药块茎的品质与产量。因此进行山药块茎淀粉积累机制的研究,对于山药品质及产量的遗传改良具有重要意义。本研究以毕克齐山药和大和长芋山药为试验材料,分别测定块茎不同发育时期的形态及淀粉积累相关生理指标;并采用RNA-seq和Iso-seq结合的转录组学测序手段对两个品种7个发育阶段的块茎转录组学进行测序,通过生物信息学分析筛选淀粉积累相关的差异表达基因;基于RNA-Seq分析结果确定淀粉积累的关键时期进行Label-free蛋白质组学测序,通过生物信息学分析筛选淀粉积累相关差异表达蛋白;将转录组学和蛋白质组学进行联合分析,从中筛选淀粉积累相关差异表达蛋白(基因)。采用RT-PCR技术克隆FRK2基因的ORF,并对该基因的ORF进行生物信息学分析;构建瞬时表达载体注射烟草叶片,对FRK2进行亚细胞定位;利用q RT-PCR技术对果糖激酶FRK2基因在山药块茎不同发育时期、不同器官CH-223191分子量以及不同胁迫条件进行表达分析,并将该基因的表达量与块茎淀粉含量、蔗糖含量及淀粉积累相关酶活性进行相关性分析;构建FRK2基因的植物表达载体,并对烟草叶片进行转化,鉴定其功能。为明确山药块茎膨大期蔗糖和淀粉代谢淀粉积累机制、山药块茎品质及产量的提高提供了理论依据。研究得出以下结论:(1)高淀粉品种毕克齐山药中块茎蔗糖合酶、果糖激酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合酶以及α-淀粉酶活性均显著高于低淀medial rotating knee粉品种大和长芋山药;块茎干物质含量、蔗糖合酶、果糖激酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合酶以及α-淀粉酶活性对淀粉积累起到正向调控的作用,蔗糖含量和蔗糖磷酸合酶活性对淀粉积累起到负向调控的作用;块茎膨大盛期淀粉颗粒体积明显增大。(2)转录组学数据分析结果表明,两个品种中共筛选到10419个差异基因,其中在高淀粉品种毕克齐山药中筛选到5478个差异基因;低淀粉品种大和长芋山药中筛选到6849个差异基因;两个品种同一时期共筛选到5177个差异基因;形态差异最大的两个比较组合(B-90 vs B-180和D-90 vs D-180)中筛选到1556个共有差异基因与淀粉积累相关(包含107个转录因子基因),这些基因的功能与代谢过程、结合和细胞过程等有关;淀粉含量差异最大的比较组合(D-150 vs B-150)中有3557个差异基因与淀粉积累相关(包含160个转录因子基因),这些差异基因的功能与结合、催化活动、代谢过程等有关。(3)蛋白质组学数据分析结果显示,在两个品种中共此网站筛选4374个差异蛋白;淀粉积累关键的两个比较组合(B-120 vs B-180和D-120 vs D-180)中筛选到2944个共有差异蛋白与淀粉积累相关(包含5个转录因子),这些差异蛋白的功能类别为代谢过程、催化活动、有机物代谢过程等;淀粉含量差异最大的比较组合(D-150vs B-150)中筛选到3229个差异蛋白与淀粉积累相关且高淀粉品种中有更多的差异蛋白高表达(包含10个转录因子),这些差异蛋白功能类别为代谢过程、催化活动、单一生物体过程等。(4)联合分析结果表明,共有3149个差异蛋白(基因)在转录组学和蛋白质组学中被共同筛选到,其中有458个(14.54%)差异蛋白(基因)与淀粉积累有关。通过q RT-PCR验证结果显示,RNA-seq数据与q RT-PCR表达量吻合程度为85.19%。(5)根据转录组学与蛋白质组学联合分析,筛选得到果糖激酶基因FRK2,克隆了FRK2基因c DNA的ORF序列。该基因c DNA全长1002bp,对基因编码蛋白进行分析,该基因编码333个氨基酸,其编码蛋白的理论分子质量为35.83k D,等电点为5.27,无跨膜结构,属于疏水性蛋白;该基因与报道的9种植物的FRK2氨基酸序列相似性均达到82%以上,在进化上其与黄姜的亲缘关系较近。亚细胞定位的结果表明该蛋白定位于细胞质和细胞膜。(6)对FRK2基因的表达模式进行分析,FRK2基因的表达量与淀粉含量显著正相关,与蔗糖含量和蔗糖磷酸酶活性极显著负相关,与蔗糖合酶活性、果糖激酶活性、AGPase活性、淀粉合酶活性和ɑ-淀粉酶活性均极显著正相关;两个品种中FRK2基因在块茎中的基因表达量显著高于叶片和茎;FRK2基因在低温胁迫和干旱胁迫下被诱导显著高表达。(7)将FRK2基因转入烟草中进行功能分析,转FRK2基因烟草淀粉含量、果糖激酶活性以及淀粉合成酶活性均极显著高于野生型烟草,转基因烟草ɑ-淀粉酶活性显著高于野生型烟草,转基因烟草果糖含量显著低于野生型烟草;对转FRK2基因烟草和野生型烟草植株进行低温胁迫,转基因烟草淀粉含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性及过氧化氢酶活性均显著高于野生型烟草,转基因烟草MDA含量显著低于野生型烟草,转基因烟草叶片中FRK2基因被显著诱导高表达;对转FRK2基因烟草和野生型烟草植株进行干旱胁迫,转基因烟草淀粉含量、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性及过氧化氢酶活性均显著高于野生型烟草,转基因烟草MDA含量和失水率均显著低于野生型烟草,转基因烟草叶片中FRK2基因被显著诱导高表达。过表达FRK2基因提高了转基因烟草的淀粉含量;该基因可以被低温和干旱诱导,提高转基因烟草的淀粉含量。