基于邻位增强效应的DNA工程化循环肿瘤细胞分离分析方法研究

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是从原发肿瘤部位脱落进入到外周血中的各类肿瘤细胞的统称,它们是肿瘤研究中一类重要的新型标志物,在癌症诊断以及治疗效果评估方面都具有很高的应用价值,因此成为肿瘤标志物研究中Baricitinib NMR广泛关注的对象。目前已有一些循环肿瘤细胞的分离分析方法被开发出来,但这些方法对不同类型的循环肿瘤细胞不具有通用性。在本论文的工作中,我们结合功能化纳米材料和工程化细胞技术,开发了一种捕获分离循环肿瘤细胞的新方法。其中,功能化纳米材料是DNA四面体核酸框架修饰的磁珠,两者之间通过生物素与链霉亲和素结合而成,DNA四面体作为一种刚性核酸结构,为捕获工程化细胞的单链DNA提供方向以及相邻位置,与其他纳米材AZD9291纯度料相比具有更好的捕获效率和生物相容性。工程化细胞则是通过对细胞进行糖代谢工程化,再通过点击化学反应使DNA修饰到细胞表面,由于肿瘤细胞比普通细胞的糖代谢速度快,DNA工程化的肿瘤细胞远多于被工程化的正常细胞,这样构建的DNA工程化肿瘤细胞能与功能化磁珠通过DNA互补结合,再通过磁吸作用可轻松地将循环肿瘤细胞从细胞群中分离出来。我们使用该方法成功构建了多种DNA工程化肿瘤细胞系,并通过磁吸作用成功进行分离。该方法可对多种循环肿瘤细胞进行分离捕获,具有较好的普适性,对于临床研究循环肿瘤细胞的分离和分析也具有较高的参考价值。论文的研究内容主要包括以下三个方面工作:1.DNA功能化磁珠的构建与表征DNA功能化磁珠是本工作中用来分离循环肿瘤细胞的纳米材料和工具,在这部分工作中,我们首先构建DNA功能化磁珠并对其进行一系列表征和考察。我们采用链霉亲和素磁珠为基底,通过亲和素与生物素的特异结合,把修饰有生物素的DNA四面体核酸框架结合在磁珠表面,得到DNA功能化修饰的磁珠。选择DNA四面体框架对磁珠进行功能化的原因是四面体具有极佳的刚性和稳定性,其顶点上向外延伸的两条单链尾巴则用于后续利用邻位增强效应去结合工程化细胞。DNA四面体核酸框架的组装过程通过琼脂糖凝胶电泳加以表征,DNA四面体核酸框架在磁珠上的修饰过程则通过DNA链上的荧光修饰加以鉴别。实验结果表明,DNA四面体可成功、稳定地修饰于磁珠的外表面,为后续捕获工程化细胞提供了有利的前提条件。2.DNA工程化细胞的构建与应用DNA工程化细胞的成功构建对循环肿瘤细胞的分离分析十分重要。其构建策略是让细胞代谢含叠氮基团的化学糖(四酰化-N-叠氮基乙酰-甘露糖胺),使细胞膜蛋白糖链带上叠氮基团,再通过点击化学反应将DNA链修饰到细胞表面,构建DNA工程化细胞。由于肿瘤细胞对糖代谢的偏爱,血液中的循环肿瘤细胞表面修饰的DNA链密度会比正常血细胞更大,从而让功能化磁珠利用邻位增强效应去捕获工程化循环肿瘤细胞成为可能。我们对三种肿瘤细胞(人宫颈癌细胞Hela,人胰腺癌细胞PATU-8988和人肝癌细胞HepG2)以及两种正常血液细胞(红细胞和白细胞)进行相同的工程化处理,再用功能化磁珠分别去结合这几种细胞,结果发现,三种肿瘤细胞均能结合功能化磁珠,而两种正常血液细胞无法跟功能化磁珠结合。这样的结果说明肿瘤细胞可被成功工程化,并能与功能化磁珠紧密结合,而正常血液细胞不可以,这是后续对血液中的循环肿瘤细胞进行分离分析的基础。3.基于邻位增强效应捕获检测DNA工程化循环肿瘤细胞本章利用DNA功能化磁珠作为细胞捕获器,对DNA工程化循环肿瘤细胞进行捕获,并对分离得到的循环肿瘤细胞进行培养和分析。通过裂解人全血中ECOG Eastern cooperative oncology group的红细胞,向所得白细胞中加入DNA工程化的肿瘤细胞来模拟外周血中工程化的循环肿瘤细胞,再用功能化磁珠和外加磁场进行捕获分离。实验结果表明,DNA功能化磁珠会结合到DNA工程化的循环肿瘤细胞上,流式细胞仪可将结合了磁珠的少量工程化循环肿瘤细胞从未结合磁珠的大量白细胞中检测分析出来;另一方面,在外加磁场的作用下,循环肿瘤细胞也可从细胞混合物中分离出来,对分离得到的循环肿瘤细胞进行常规的细胞培养后发现,细胞生长和增殖态势良好,72 h内可铺满培养皿,活细胞率达到95%以上。以上结果对不同种类的两种肿瘤细胞(人宫颈癌Hela细胞和人肝癌HepG2细胞)均适用,说明我们发展的DNA工程化循环肿瘤细胞分离分析方法具有较好的普适性。