当前,我国犊牛腹泻疾病病因复杂,新发病毒性传染病和病毒变异不断发生,严重影响了我国犊牛健康。传统病原检测技术已不能满足动物传染病快速诊断需求。随着基因测序技术不断发展,基于二代测序技术的病毒宏基因组学(Viral Metagenomics,VM)已被用于犊牛肠道病毒群落分析。目前,针对大庆地区奶牛种群内犊牛肠道VM检测的研究相对较少。因此,本研究针对大庆地区奶牛种群内犊牛肠道病毒群落组成进行系统调查,查明地方流行毒株的遗传变异情况,进而调查犊牛肠道病毒生态学变化,对牛源病毒性传染病具有预警意义。本研究基于Illumina Nova Seq6000测序平台的VM技术,分析了大庆市9个规模化奶牛养殖场155份犊牛粪便样品的病毒群落mutagenetic toxicity组成,比较了腹泻犊牛与临床无腹泻症状犊牛肠Cytoskeletal Signaling抑制剂道内病毒群落的差异;针对VM检出国内新发的牛诺如病毒(Bovine Norovirus,BNoV)、牛嵴病毒(Bovine Kobuvirus,BKV)和牛环曲病毒(Bovine Torovirus,BToV)建立了三重RT-PCR检测方法,对其流行情况进行了调查,对病毒基因遗传进化特点进行了系统分析。主要研究结果如下:(1)对构建的9个粪便混合样本池进行高通量测序,数据共计193.13 G,质控后注释获得21个病毒科的6 517 147条病毒相关读长序列。根据De Brujin算法从头组装,获得53 571条重叠群序列。脊椎动物病毒共注释到202 197条读长序列,占犊牛肠道病毒群落组成的3.10%,主要由细小病毒科、圆环病毒科、小环状DNA病毒科、呼肠孤病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、疱疹病毒科、多瘤病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科、杯状病毒科、星状病毒科、正黏病毒科及逆转录病毒科等14个病毒科组成。其中,冠状病毒科共注释到47 069条读长,占比最高,可达0.72%。通过比较临床无腹泻症状犊牛与腹泻犊牛肠道病毒群落,发现腹泻组文库中细小病毒科、小RNA病毒科及呼肠孤病毒科平均相对丰度为临床无腹泻症状组文库的3.05倍、1.54倍及5.61倍。组装到98条牛轮状病毒、26条牛细小病毒、28条牛肠道病毒、145条牛嵴病毒及15条牛匈牙利病毒等相关重叠群序列,可能为导致犊牛腹泻的主要病毒。临床无腹泻症状组也检出多种病毒(主要包括圆环病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、星状病毒科、细小病毒科、小RNA病毒科、呼肠孤病毒科)核酸。通过序列组装获得了牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛星状病毒近全基因组序列。遗传进化分析表明,VM组装获得的毒株基因序列与我国流行毒株亲缘关系密切,具有明显的地理聚类性与遗传多样性。成功组装到BNoV、BKV、BToV与牛纽布病毒(Bovine Nebovirus,BNe V)等国内新发牛源病毒,文库间组装结果阳性率分别为66.66%、77.77%、77.77%、44.44%。BNoV、BKV、BToV在测序文库间组装结果阳性率超过Wnt-C59采购50%,表明此3种病毒已存在于大庆地区犊牛种群。(2)针对VM检出的BNoV、BKV、BToV三种病毒,通过分别靶向BNoV Rd Rp基因、BKV 3D基因、BToV N基因保守区域各设计1对引物,成功建立了一种特异鉴别BNoV、BKV和BToV的三重RT-PCR检测方法。该方法针对BNoV、BKV、BToV质粒标准品最低检测限分别为2.73×10~4 copies/μL、2.87×10~4 copies/μL、3.18×10~3 copies/μL。通过建立的三重RT-PCR方法对153份犊牛粪便样品检测发现,3种病毒混合感染阳性率达7.18%,BNoV、BKV及BToV阳性检出率分别为11.11%、25.49%、38.56%。与其他学者建立的单一RT-PCR检测方法进行符合率比对,针对上述3种病毒检测结果的符合率分别为94.77%、93.46%、91.50%。针对三重RT-PCR检测阳性样品进一步通过基因测序,结果表明BNoV高致病性基因型GⅢ.1与优势流行基因型GⅢ.2均在大庆地区检出;大庆地区BKV阳性检出样品核苷酸相似性高于90%,且均归为Aichivirus B型,与国内流行毒株亲缘关系较近,与Aichivirus D型毒株亲缘关系较远;BToV阳性检出样品核苷酸相似性高于97%,具有明显的宿主特异性,但与原始经典毒株Breda 1的遗传距离较远。本研究初步探索了大庆地区规模化奶牛养殖场犊牛粪便的病毒群落组成,为犊牛病毒性腹泻的病原学诊断提供了理论依据。同时,本研究建立了BNoV、BKV、BToV三重RT-PCR检测方法,为上述3种病毒检测及分子流行病学调查提供了技术支撑。