肺癌是世界范围内发病率和死亡率均非常高的呼吸系统恶性肿瘤。国际癌症研究机构编制的癌症负担数据提示,2020年全球肺癌的新发和死亡例数分别位居所有类型恶性肿瘤的第二位和第一位;而在我国,2022年肺癌的发病和死亡例数均位居第一。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的组织病理学类型,由于其早期症状不明显,多数患者发现时已属晚期。近年来,新型分子靶向药物的不断涌现,为不同基因类型(如EGFR、ALK和BRAF等)突变的晚期NSCLC患者带来了令人瞩目的希望,但目前尚无针对性治疗TP53突变型NSCLC的分子靶向药物。安罗替尼(anlotinib)是我国自主研发的一种新型、口服的小分子、多靶点酪氨酸激酶抑制剂,它既能通过作用于血管内皮生长因子受体(VEGFR)而发挥阻碍肿瘤新血管生成的作用,也可以通过作用于干细胞因子受体(KIT)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)等靶点而起到抑制肿瘤生长的作用。安罗替尼在多个针对实体肿瘤的临床研究中均展现出较好的疗效,目前已获批用于治疗晚期NSCLCMRTX849 MW、软组织肉瘤、小细胞肺癌(SCLC)和甲状腺髓样癌等多种类型肿瘤。近年来,有学者在临床实践中发现,安罗替尼能够为既往治疗失败的TP53突变型NSCLC患者带来较为不错的生存获益。但目前安罗替尼治疗TP53突变型NSCLC的机制尚不明确,这便是本研究的主要内容。目的:研究安罗替尼对H1299肺癌细胞(TP53突变型)的增殖抑制作用及机制。利用蛋白质组学技术比较安罗替尼处理前后H1299肺癌细胞蛋白表达谱的差异,以探寻安罗替尼抑制肺癌细胞增殖的作用机制。方法:(1)利用CCK-8实验检测安罗替尼对A549(TP53野生型)、H1299(TP53突变型)肺癌细胞增殖的影响。(2)采用液相色谱串联质谱为基础的非标记定量蛋白质组学技术鉴定和筛选安罗替尼处理前后H1299肺癌细胞的差异表达蛋白。(3)利用生物信息学技术将差异表达蛋白提交生物信息学网站(DAVID、PANTHER、STRING)进行分析,旨在发现安罗替尼可能通过p53相关信号通路抑制H1299肺癌细胞增殖。selleckchem LBH589(4)采用Western Blot实验检测安罗替尼处理后的A549、H1299肺癌细胞的差异蛋白的表达情况。以差异蛋白ELAVL1和HDAC2验证蛋白质组学的研究结果,以p53信号通路相关差异蛋白CDK1和MAP2K3验证MAP2K3-p53-CDK1信号通路假说的可能性。结果:(1)安罗替尼在1~64μM浓度范围内以剂量依赖性和时间依赖性方式抑制A549、H1299肺癌细胞的增殖。相较于A549肺癌细胞,安罗替尼在8~64μM浓度范围内对H1299肺癌细胞增殖的抑制作用更强。(2)在H1299肺癌细胞的蛋白质组学研究中,共鉴定出3200个可信蛋白。根据差异表达倍数和显著性差异分析筛选差异表达蛋白,共筛选出126个差异表达蛋白,其中上调的差异表达蛋genetic lung disease白37个,下调的差异表达蛋白89个。(3)利用生物信息学分析筛选出与p53信号通路相关的主要差异蛋白为CDK1和MAP2K3。CDK1能够与细胞周期蛋白B(Cyclin B)形成Cyclin B/CDK1复合物,在调控细胞周期的起始、进展和终止过程中发挥重要作用。MAP2K3可以特异性激活p38,p38影响其下游转录因子p53的表达,进而调控细胞凋亡。(4)Western Blot实验结果显示,安罗替尼能够上调HDAC2的表达、下调ELAVL1的表达,与H1299肺癌细胞蛋白质组学的研究结果一致。相较于A549肺癌细胞,安罗替尼对H1299肺癌细胞p53信号通路相关差异蛋白CDK1和MAP2K3的下调作用更为显著。结论:相较于A549(TP53野生型)肺癌细胞,安罗替尼对H1299(TP53突变型)肺癌细胞增殖的抑制作用更强。蛋白质组学及生物信息学技术表明,介导安罗替尼发挥上述作用的与p53信号通路相关的重要靶蛋白是CDK1和MAP2K3。Western Blot实验结果也证实,安罗替尼能够显著下调CDK1(p53通路下游蛋白)和MAP2K3(p53通路上游蛋白)的表达。我们通过本研究结果推测,安罗替尼抑制MAP2K3-p53-CDK1信号通路可能是其治疗TP53突变型NSCLC的重要机制。