【目的】宣威肺癌表现出明显的性别和地域差异,女性发病率更高,病理分型以腺癌为主,但其病因和机制却知之甚少。本研究拟从多组学层面揭示宣威女性肺腺癌特异性的分子特征,为临床上宣威女性肺腺癌的诊疗提供科学依据和潜在的治疗靶点。【方法】(1)本研究前瞻性地收集了169例宣威地区女性肺腺癌患者的肿瘤组织及邻近正常组织样本。这169例女性患者均从不吸烟(一生中吸烟少于100支),未经任何治疗且首次确诊为原发性肺腺癌。(2)使用全外显子组测序、转录组测序、蛋白质非标记定量和磷酸化蛋白质非标记定量技术分别检测了135、136、102和102个肿瘤样本和135、36、20、20个配对的正常组织样本,进行多组学分析。(3)组学分析筛选出DHX9可能是p53突变型肺癌患者潜在的治疗靶点。选取p53野生型肺癌细胞系A549和p53缺失肺癌细胞系Calu-1,构建p53野生型和突变型慢病毒载体,DHX9干扰与过表达慢病毒载体,慢病毒包装细胞系包装,感染A549和Calu-1细胞并使用嘌呤霉素进行筛选。(4)使用q RT-PCR和western blot检测相关基因在m RNA和蛋白层面上的表达水平。(5)使用CCK-8方法检测肺癌细胞的增殖能力;划痕愈合实验检测肺癌细胞的迁移能力;Transwell检测肺癌细胞的侵袭转移能力;流式细胞术检测肺癌细胞周期和凋亡。(6)使用回复实验分析p53突变通过DHX9/PCNA/CDK2调控肺癌发展。(7)使用裸鼠皮下成瘤实验在体内研究DHX9在p53突变型肺癌中的生长促进作用。(8)使用免疫组化和western blot检测裸鼠肿瘤中相关蛋白的表达。(9)使用TUNEL染色检测裸鼠肿瘤中细胞的凋亡情况。【结果】(1)全外显子组分析鉴定出了37149个体细胞突变,包括1797个插入缺失突变、32972个错义突变、2345个无义突变和35个不间断突变;拷贝数分析揭示了40个染色体区段上存在140396个基因水平的扩增和67605个缺失;使用m RNA-seq检测出了19182个基因的转录谱;蛋白质与磷酸化蛋白质组分析检测出了1795种蛋白质和476种磷酸化蛋白质在肿瘤样品中表达上调。(2)在蛋白水平上,RNA代谢、翻译、细胞内蛋白质转运等寻找更多生物学过程发生上调,而在蛋白质磷酸化水平上,染色质组织结构、RNA代谢、DNA代谢等生物学过程出现上调。p53突变型样本中,DHX9、SF的蛋白水平及SF1＿S82的磷酸化水平显著上调,且与较差的预后相关。DHX9和SF1可能是p53突变型肺癌患者潜在的治疗靶点。(3)与EGFR单突变样immune-epithelial interactions本相比,在TP53/EGFR双突变样本中,Notch信号传导通路受到显著干扰,且下调的Notch信号通路可能会减弱效应型单核细胞的杀伤能力。相比于TP53/EGFR双突变样本,TP53单突变样本中存在广泛的代谢重编程,包括柠檬酸循环和呼吸电子传递、氨基酸及其衍生物的代谢、脂类和嘧啶代谢https://www.selleck.cn/products/AZD1152-HQPA.html、t RNA氨酰化等代谢过程显著上调。(4)在EGFR/RTK-RAS通路中,EGFR和RTK-RAS通路基因的双突变赋予了癌细胞更强的糖酵解能力,糖酵解通路和相关酶显著上调。(5)通过构建受驱动突变干扰的PPI网络,进行蛋白质-蛋白质相互作用组分析,发现了多个受到突变影响的蛋白相互作用,如MAD1-MAD2、TPRN-PPP1CA等;富集分析显示有丝分裂细胞周期调控、RTK信号转导、DNA损伤刺激反应等生物学过程显著富集。MAD1 p.Arg558His突变极大程度地削弱了MAD1-MAD2的相互作用,并可能通过抑制姐妹染色单体在细胞分裂中期-后期转变时的分离,最终导致肺癌的发生;TPRN p.His550Gln突变也在极大程度上削弱了TPRN-PPP1CA的相互作用,可能导致丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶的功能失调,引起去磷酸化的阻滞,最终导致肺癌的进展。(6)在冷肿瘤亚型中,甘露糖基化、细胞氨基酸生物合成过程、硫化物氧化、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成等是冷肿瘤样本中最重要的生物学途径。(7)使用p53野生型和突变型慢病毒载体与DHX9干扰与过表达慢病毒载体转染A549和Calu-1细胞后,通过荧光显微镜和q PCR检测,DHX9被成功干扰和过表达。相比p53野生型敲低组细胞,在p53突变型细胞中敲低DHX9后,细胞的增殖能力明显减弱,细胞侵袭穿过基质胶数量明显减少,细胞凋亡比例明显增高,EMT相关蛋白和VEGF表达受到抑制。在过表达DHX9后,p53突变组较p53野生组细胞的愈合能力明显增强,G1期细胞的比例显著减少。(8)在p53突变型A549细胞中过表达或敲低DHX9,PCNA、CDK2蛋白的表达出现了相应的上调或下调。在过表达DHX9的同时加入PCNA抑制剂,CDK2蛋白的表达也出现了下调,CCK8实验显示肺癌细胞的增殖能力较前明显减弱。(9)相比于p53野生型组,在p53突变组中过表达DHX9后裸鼠成瘤体积及瘤重明显增大,E-cadherin下调,N-cadherin、Vimentin、VEGF、PCNA、CDK2表达上调;敲低DHX9后裸鼠瘤体中细胞凋亡比例明显增加。【结论】(1)宣威女性肺腺癌多组学分析分别从全外显子组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组水平上,鉴定出了大量发生突变的基因和表达失调的蛋白及下游生物学过程,这些差异可能存在更深的机制。(2)DHX9和SF1可能是p53突变型肺癌患者潜在的治疗靶点。(3)对失调的Notch信号通路进行干预可作为TP53/EGFR双突变肺癌患者的辅助治疗方法。对于EGFR/RTK-RAS通路基因发生双突变的患者,抑制肿瘤细胞的糖酵解途径可能会得到更显著的治疗效果。(4)开发MAD1-MAD2和TPRN-PPP1CA相互作用的抑制剂可能是治疗宣威女性肺腺癌的有效药物。(5)谷氨酰胺代谢途径可能是宣威女性肺腺癌冷肿瘤亚型的潜在治疗靶点。(6)DHX9可能通过上调PCNA/CDK2轴促进p53突变型肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭及G1期进程,抑制其凋亡,并可能通过上调EMT相关蛋白和促肿瘤血管生成来促进p53突变型肺癌的进展。