背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD),是全球范围内最常见的慢性气道疾病,其特征其特征是由于呼吸道异常和肺泡引起的慢性呼吸道症状,导致持续的、反复恶化的气流阻塞,并伴有极高的死亡率和致残率。COPD的危险因素包括遗传因素、吸烟和气道炎症等,其中吸烟是最主要的危险因素。与此同时,有研究证实,铁与铁死亡在COPD的发生发展中起着至关重要的作用,但具体机制尚未完全阐明。目前,COPD的一线治疗策略仍是支气管舒张剂,所有表型的COPD对吸入激素的获益均不显著。因此,寻找COPD气道炎症治疗新靶点与新型药物,是COPD防治核心待解决的问题。许多源自植物的天然产物在体外和体内均显示出显着的呼吸系统疾病抗炎活性。异鼠李素(Isorhamnetin,ISO),是一种从沙棘果实和银杏叶中分离出来的天然黄酮类化合物。ISO发挥作用的主要的机制与抗氧化和抑制活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生有关,而这些因素与铁死亡的发生显著相关。因此探究ISO是否可通过抑制铁死亡通路对COPD起治疗作用值得深入研究。目的(1)基于生物信息学分析,揭示COPD的铁死亡调控网络,阐述气道上皮的铁死亡与COPD发生与发展的关系。(2)通过网络药理学分析,探究ISO作用于COPD的潜在药理学靶点及机理。(3)通过细胞与动物实验,探究ISO作用于COPD的疗效,阐述ISO通过抑制铁死亡通路减轻COPD的气道炎症。方法第一部分:(1)基于GEO(Gene Expression Omnibus,GEO)公共数据库,筛选出与“COPD”及“Airway epithelial”相关的数据集;(2)3个COPD气道上皮数据集,用于COPD气道上皮差异表达的基因(Differential expression gene,DEGs),进一步筛选在3个数据集中共同差异表达的基因作为靶基因,并利用Cytoscope的cytohubba插件筛选出5%的基因作为关键基因;(4)从Ferr Db铁死亡数据库获得铁死亡基因集,通过比对DEGs与关键基因,筛选出COPD铁死亡关键基因(Ferroptosis-related Hub Genes,FRHGs);(5)利用生物信息学方法对FRHGs进行分析,包括:构建蛋白质-蛋白质相互作用网络(Protein-Protein Interaction,PPI)、mi RNA-m RNA调控网络、基因本体论与京都基因与基因组百科全书分析和基因组富集分析;(6)通过独立的验证数据集验证FRHGs的诊断价值;(7)通过2个独立数据集分析吸烟是否影响FRHGs表达;并进一步探究戒烟是否可以逆转吸烟引起的FRHGs差异性表达。第二部分:(1)在Pubchem数据库下载异鼠李素的二维分子结构,将其上传到Swiss Target Prediction数据库与Similarity ensemble approach数据库,收集ISO作用靶基因集;(2)对ISO作用靶基因集与第一部分得selleckchem Alisertib到的COPD气道上皮DEGs进行韦恩图重复项分析,重叠部分即为ISO作用于COPD的潜在药理学靶点;(3)对ISO作用于COPD潜在靶点进行网络药理学分析,包括:构建PPI网络、基因本体论与京都基因与基因组百科全书分析和基因组富集分析;(4)结合第一部分的结果,对ISO与COPD潜在作用靶点进行分子对接实验。第三部分:(1)细胞学实验:1)运用BEAS-2B细胞研究CSE的有害作用、ISO的潜在益处及其机制。2)CCK-8和Annexin V/PI双染色法实验分别检测细胞活力和细胞凋亡。3)用试剂盒测定MDA与GSH/GSSH的含量变化。4)透射电镜观察对照组与实验组细胞线粒体形态。5)免疫荧光观察对照组与实验组NRF2、SLC7A11与GPX4的表达情况。(2)动物实验:1)建立COPD小鼠熏烟模型,随机分组:CON组、CS组和CS+ISO组。2)小鼠在暴露烟草烟雾(Cigarette smoke,CS)90天后,进行肺功能测定。3)肺功能检测结束后,对小鼠进行心脏采血,进行红细胞计数和血细胞比容分析。4)从GEO数据库下载COPD熏烟小鼠模型的肺组织m RNA数据集,分析差异表达基因与其富集的通路。5)对不同组小鼠肺组织病理学检查和形态学分析。6)Western印迹法检测肺组织NRF2、SLC7A11与GPX4表达水平。结果第一部分:(1)通过对3个COPD气道上皮数据集进行转录组学分析,共获得220个DEGs,其中表达上调157个,表达下调63个。(2)基于220个DEGs构建一个有190个节点和265条边,平均节点度为2.79的PPI网络。(3)使用Cytoscape确定了13个关键基因。(4)使用Ferr Db数据库比对关键基因筛选出7个COPD铁死亡关键基因,即NQO1、AKR1C3、AKR1C1、GPX2、TXNRD1、SRXN1、SLC7A11。(5)通过GO和KEGG富集分析与GSEA分析得这7个基因主要涉及氧化应激通路并受NRF2信号通路调控。(6)基于这7个基因构建出一个含281个mi RNA和359对m RNA-mi RNA对的mi RNA-m RNA调控网络。(7)这7个基因对COPD吸烟者的诊断具有显着价值。(8)7个铁死亡关键基因的表达在非吸烟健康者、吸烟健康者到吸烟COPD患者三者中呈现不断上升的趋势。(9)即便是短暂接触烟草烟雾,这7个基因表达都会上调,但戒烟后这些基因表达可降低至正常水平。第二部分:(1)从Swiss Target Prediction数据库checkpoint blockade immunotherapy与Similarity ensemble approach获得195个异鼠李素的潜在靶点。(2)将195个异鼠李素的潜在靶点与第一部分研究中获得的220个DEGs进行维恩图分析,获得11个重叠目标,即为ISO作用于COPD的潜在药理学靶点。(3)对这11个药理学靶点主要涉及氧化还原等生物过程。(4)基于11个药理靶点构建一个有11个节点和24条边,平均节点度为4.36的PPI网络。(5)使用Cytoscape确定了5个关键靶点。(6)分子对接实验显示ISO能与NRF2、SLC7A11、NQO1、AKR1C3和AKR1C1这5个靶基因蛋白结构有较好的结合。第三部分:(1)通过CCK8检测细胞活力,确定了浓度为0.08%CSE和40μM的ISO进行BEAS-2B细胞实验。(2)光镜下,CSE组和Erastin组显著减少细胞数量,而使用ISO和Fer-1可以显著改善细胞死亡情况。(3)CSE组和Erastin组显著增加BEAS-2B细胞中膜联蛋白PI阳性细胞,而使用ISO和Fer-1可以显著降低细胞膜PI阳性细胞。(4)与对照组相比,CSE和Erastin处理的BEAS-2B细胞MDA水平显著升高,而ISO和Fer-1均显著抑制CSE诱导的MDA升高。此外,在CSE和Erastin处理的BEAS-2B细胞中,GSH和GSH/GSSG下降且GSSG升高,而ISO和Fer-1处理后均显著减轻CSE处理诱导的指标改变。(5)透射电镜观察BEAS-2B细胞线粒体的形态学变化,结果显示,相比于对照组,CSE组和Erastin组线粒体形态学发生明显铁死亡改变(线粒体缩小、膜密度增高、嵴减少甚至出现外膜破裂),但使用ISO和Fer-1干预后线粒体形态得到显著改善。(6)与对照组相比,CS组小鼠的体重明显降低、HCT和外周血红细胞数量显著增加,使用ISO干预后,这些指标的趋势得到了逆转。(7)与对照组相比,CS暴露的小鼠表现出明显的气流受限和肺过度膨胀与准静态顺应性增加,而使用ISO干预后,显著降低了FVC和RI的增加,并且降低了CS暴露引起的FEV0.1/FVC和准静态顺应性的恶化。(MLN4924说明书8)熏烟小鼠肺组织m RNA数据集生信分析结果显示差异基因在铁死亡通路上显著富集。(9)与对照组相比,CS诱导的COPD小鼠肺部的组织病理学分析显示肺泡扩张、肺泡壁受损和肺泡壁融合。此外,CS组肺组织与对照组相比有明显的炎症改变,表现为支气管壁增厚、上皮细胞紊乱、大量炎性细胞浸润。与对照组相比,CS组的MAA和MLI均增加。使用ISO显着减弱了这些组织学损伤。此外,与CS组相比,ISO干预显着抑制了CS诱导的COPD的肺气肿和炎性细胞浸润,能有效降低病理评分。(10)使用ISO干预可显著逆转CS诱导的NRF2、SLC7A11和GPX4蛋白表达下降。(11)与对照组相比,CS组小鼠肺组织MDA水平显著升高、GSH与GSH/GSSG下降且GSSG升高,使用ISO可显著逆转这种改变。(12)CSE组与Erastin组显著抑制BEAS-2B的NRF2、SLC7A11与GPX4表达,但ISO与Fer-1干预后可显著逆转这种改变。结论1.基于生物信息学分析揭示了220个COPD气道上皮差异性表达基因。进一步筛选出7个具有良好诊断特性的潜在COPD铁死亡关键基因,并构建了mi RNA-m RNA调控网络。7个COPD铁死亡关键基因主要涉及氧化应激等生物学过程,且均受NRF2通路调节。吸烟会引起这7个基因的高表达,而戒烟后可以逆转这种高表达。2.利用网络药理学预测11个基因可能是ISO作用于COPD的潜在药理靶点。利用分子对接实验证实ISO能够靶向作用NRF2、SLC7A11、NQO1、AKR1C3和AKR1C1这五个靶点。3.通过细胞与动物实验发现ISO具有抑制气道上皮铁死亡的药理活性,证实了ISO能够在体内外减轻烟草烟雾引起的气道上皮铁死亡,进而缓解COPD气道炎症,并进一步发现NRF2/SLC7A11/GPX4通路在ISO减轻COPD气道炎症中起着关键作用。