微管(Microtubules,MTs)是真核细胞细胞骨架的重要组成成分之一,直接参与细胞的物质运输、形态建成和细胞分裂等生物学过程。在细胞中,微管呈现高度动态的聚合和解聚等过程,并形成动态变化的微管阵列。在植物细胞中,微管在细胞周期不同阶段形成多种微管阵列,包括周质微管、早前期带、纺锤体和成膜体等,从而精细调控植物细胞的分裂与形态建成。研究表明,一系列微管结合蛋白与微管直接结合,调控微管动态和阵列排布,与微管共同行使生物学功能。拟南芥MICROTUBULE ORGANIZATION 1(MOR1)蛋白是MICROTUBULEASSOCIATED PROTEIN 215(MAP215)家族微管结合蛋白成员。MAP215家族蛋白在真核生物中广泛存在,一般认为其作为微管聚合酶和微管成核因子参与调控微管动态。拟南芥MOR1基因是一个必需基因Dorsomorphin核磁,其功能缺失突变致死,文献报道的突变体大多为温度敏感突变体,在正常生长条件下无明显表型,从而限制了MOR1基因的进一步功能研究;此外,由于MOR1蛋白分子量较大,文献尚未报道全长MOR1蛋白融合荧光蛋白标签的转基因植物,从而无法在活细胞中直接观察MOR1蛋白的动态变化。本研究利用遗传学和细胞生物学等手段,获得了非致死MOR1基因等位突变,获得了表达融合绿色荧光蛋白(Green fluorscent protein,GFP)的MOR1-GFP转基因植物,解析了MOR1参与微管动态调控的分子机制,以及对植物生长发育的影响。研究结果如下:(1)根据拟南芥主根伸长对微管解聚药物Propyzamide的敏感性筛选拟南芥突变体库,获得了超敏感突变体propyzamide over-sensitive 1-1/mor1-10(pos1-1/mor1-10)及另外两个等位突变体pos1-2/mor1-11和pos1-3/mor1-1。基因克隆结果表明这些突变体中MOR1基因发生点突变造成蛋白错义突变。在药物处理条件下,相较野生型,mor1-10突变体的微管聚合与解聚速度均显著下降,微管阵列出现多种形态异常,进而导致了细胞的异常分裂和细胞扩张各向异性缺失,表明MOR1参与了微管动态的调控,并调控细胞的分裂与扩张。在正常培养条件下,mor1-10表现出植物的左旋生长表型。这些特异等位突变体的获得,为进一步研究MOR1基因功能提供了遗传学材料。(2)构建了内源MOR1启动子控制的MOR1全长基因组DNA融合GFP荧光蛋白标签编码序列的转基因二元载体,并成功回复了mor1-10突变体的药物敏感性和其他表型,表明转基因植物中表达的MOR1-GFP能够行使MOR1生物学功能。利用表达MOR1-GFP的转基因植物,在活细胞中观察了全长MOR1的动态变化。发现MOR1-GFP信号定位于各阶段微管阵列,包括早前期带、纺锤体、成寻找更多膜体以及间期周质微管。在周质微管中,MOR1-GFP信号定位于微管,并在微PCR Equipment管正末端富集,随着微管聚合追踪微管正末端。(3)发现MOR1与拟南芥KATANIN 1(KTN1)基因之间存在遗传互作关系。KTN1编码微管剪切蛋白katanin的p60催化亚基。相比各自单突变体,mor1-10 ktn1-7双突变体表现出更强烈的短根表型。进一步研究发现mor1-10 ktn1-7细胞分裂异常情况增加,细胞扩张失去各向异性,表明MOR1与KTN1协同作用调控细胞分裂与扩张。基于MOR1与KTN1的功能关系,通过多种蛋白互作实验手段发现并验证了MOR1通过其碳端结构域与KTN1发生直接的蛋白相互作用。(4)获得并观察了MOR1和KTN1双重荧光标签植物,发现二者在早前期带和成膜体上存在明显的共定位;同时在周质微管中,二者于微管交叉或分支处存在共定位。在mor1-10突变体中,KTN1介导的微管剪切频率下降,微管剪切等待时间提高,并进一步发现微管剪切等待时间的提高是由于潜在剪切位点招募KTN1所需时间延长所导致的。这些结果表明MOR1参与了潜在微管剪切位点对KTN1的招募,并正调控KTN1介导的微管剪切。综上,本研究通过特异非致死MOR1等位突变体的筛选获得,表达有功能的MOR1-GFP转基因植物的构建和MOR1的活细胞成像,揭示了MOR1的动态变化特征,发现了MOR1与KTN1通过直接相互作用协同调控微管动态与微管阵列排布从而调控植物生长发育的新机制,为植物微管细胞骨架调控生长发育的遗传调控网络提供了新信息。