目的：拯救携带OX40L的重组溶瘤流感病毒株，全面鉴定并评价其靶向杀伤肝癌细胞的效果。方法：将编码OX40L的基因片段嵌合在A/PuertoRico/8/34（PR8）的NS片段特定位置，利用反向遗传学技术（Reverse genetics，RG），与PR8流感病毒的剩余7个骨架质粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M共转染COS Ⅰ/MDCK细胞，成功拯救获Stochastic epigenetic mutations得重组溶瘤流感病毒，命名为rFlu-OX40L。经血凝、TCID_(50)方法测定病毒滴度；重组病毒纯化后电镜观察病毒形态特征及大小分布；MDCK细胞检测病毒生长曲线；MTS法检测重组病毒对肝癌细胞活力的影响；流式细胞术检测重组病毒诱导肝癌细胞死亡方式；利用肝癌荷瘤小鼠模型评价重组病毒rFlu-OX40L在动物体内的抗肿瘤效果。结果RAD001：重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L可在鸡胚中稳定传代，HA效价达2~(7～8)，病毒滴度可达7～8LogTCID_(50)/mL；重组病毒rFlu-OX40L与流感病毒PR8生长曲线相一致，72h达高峰；MTS结果显示，3MOI重组病毒可显著降低肝癌细胞活力KD025，且对正常肝细胞无明显影响，呈时间和剂量依赖性；流式细胞结果显示重组病毒可显著诱导肝癌细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性；利用肝癌荷瘤小鼠模型，瘤内注射重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L较PR8、PBS对照组，小鼠脾细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD69+ T细胞数量呈现显著升高趋势。结论：携带OX40L的重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L在体内外均可选择性杀伤肝癌细胞，有望为肝癌的临床治疗提供新的免疫治疗策略。