目的:血管内膜增生(Intimal hyperplasia,IH)是血管外科手术引发的血管腔再狭窄的重要原因,仍是临床亟待解决的重要难题。局部炎症的激活是血管内膜损伤引发IH的重要病理机制之一。课题组研究发现,中药满山红有效成分杜鹃素可有效抑制大鼠IH及H_2O_2诱导的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)中IL-1β等炎症因子的释放,并且基本确证杜鹃素可与葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,Grp78)直接结合,但其作用机制尚未阐明。故本研究分别采用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导A7r5细胞炎症模型和球囊损伤诱导大鼠颈总动脉血管内膜增生模型,考察杜鹃素通过靶向结合Grp78调控VSMCs炎症反应抑制IH的作用机制,为明确杜鹃素等黄酮类化合物作用靶点、机制提供数据支撑,为其开发和利用奠定基础。方法:1.以核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain,leucine-rich repeat and pyrin domain containing 3,NLRP3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1)的表达、白细胞介素18和1β(Interleukin 18 and 1β,IL-18,IL-1β)的分泌及核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)的p65蛋白的入核情况为指标,考察杜鹃素对AngⅡ诱导的A7r5细胞中NLRP3炎症小体活性及NF-κB信号通路的影响。2.通过转染si Grp78和pc DNA3.1(+)-Grp78质粒,使A7r5细胞中Grp78蛋白沉默和过表达,考察Grp78蛋白与A7r5细胞中NLRP3炎症小体活性及NF-κB信号通路间的关系。3.采用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)、蛋白酶体抑制剂MG-132、溶酶体自噬降解途径中关键ATP驱动的液泡型ATP酶(V-ATPase)抑制剂巴非洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf-A1),考察杜鹃素诱导Grp78表达水平降低的作用机制。4.采用蛋白免疫印迹(Western-Blot,WB)方法检测Grp78、NLRP3、Caspase-1蛋白表达;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测IL-1β、IL-18等炎症因子指标;采用免疫荧光法考察NF-κB p65的入核活化情况。5.采用球囊诱导血管内膜损伤建立大鼠颈总动脉血管内膜增生模型。分别将杜鹃素(18 mg/kg、36 mg/kg)、阳性药4-PBA与25%pluronic F-127混合,于损伤血管周围局部给药,于术后特定时间取手术部位血管段。6.采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色法)观察血管内膜增生情况,用免疫组织化学法检测血管中Grp78与NLRP3蛋白,观察其表达情况。结果:1.杜鹃素可有效降低AngⅡ诱导的细胞炎症因子IL-1β、IL-18的分泌、细胞中Caspase-1和NLRP3蛋白的表达及细胞核中p65的表达,提示杜鹃素通过调控NF-κB-NLRP3炎症小体通路抑制AngⅡ诱导的A7selleck激酶抑制剂r5细胞的炎症反应。2.杜鹃素可有效抑制AngⅡ诱导的A7r5细胞中Grp78的高表达,当沉默Grp78表达后,可有效降低AngⅡ诱导的细胞炎症因子IL-1β、IL-18的分泌、细胞中Caspase-1和NLRP3蛋白的表达及细胞核中p65的表达。3.杜鹃素可有效抑制Grp78过表达诱导的细胞炎症因子IL-1β、IL-18的分泌、细胞中Caspase-1和NLRP3蛋白的表达及细胞核中p65的表达,证明杜鹃素经靶向LaduviglusibGrp78调控NF-κB-NLRP3炎症小体通路抑制AngⅡ诱导的VSMCs的炎症反应。4.以CHX和杜鹃素同时处理细胞,Grp78的表达水平比CHX单独作用时显著减少,提示杜鹃素可促进Grp78的降解。用Baf-A1处理细胞能拮抗杜鹃素诱导的Grp78的减少,而MG-132对杜鹃素诱导的Grp78的减少无显著性影响,提示杜鹃素可能通过溶酶体途径加速Grp78的降解。5.HE染色、免疫组织化学检测结果表明,球囊损伤可诱导大鼠颈总动脉血管内膜增生,新生内膜中Grp78和NLRP3均高表达;杜鹃素可有效抑制球囊损伤诱导的大鼠颈总动脉血管内膜增生,进而抑制Grp78、NLRP3的表达。结论:杜鹃素经溶酶体途径诱导Grp78蛋白降解,调节VSMCs中NF-κB信号通路,抑制NLRP3炎症小体激活,减少炎症因子IL-1β、IL-18的释放,OIT oral immunotherapy进而抑制球囊损伤诱导的大鼠颈总动脉血管内膜增生。