中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),俗称大闸蟹、河蟹,是我国虾蟹类养殖的重要品种之一,味道鲜美,营养丰富,具有重要的经济价值。中华绒螯蟹具有洄游习性,通常在淡水中生长发育,性腺成熟时洄游至海水或河口区域生殖繁衍后代。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一类兼性厌氧的革兰氏阴性、短杆菌,不具有芽孢和荚膜。广泛分布于养殖水体、入海口、河口和咸水湖泊等地,具有很强的致病性,对水生生物与人类均具有感染性。本试验在建立感染模型的基础上,从临床症状、组织病理学变化、酶活力变化、免疫相关基因表达与转录组学等方面,对比研究Pexidartinib使用方法中华绒螯蟹抵抗溶藻弧菌感染的免疫防御机制,分析其转录组变化和差异表达基因,探究中华绒螯蟹应对细菌感染的免疫防御机制,为中华绒螯蟹的健康养殖提供基础试验数据。主要研究方法与结果如下:(1)通过实验室攻毒试验,建立了中FUT-175体内华绒螯蟹的溶藻弧菌急性感染模型。根据寇氏改良公式,计算得出24 h的半数致死量为1.93×10~6CFU/m L。(2)中华绒螯蟹被溶藻弧菌感染后6 h出现活力减弱,运动能力衰退,刺激后无闪避行为,人为倒置不能迅速翻转等临床症状。解剖后发现其肝胰腺颜色变淡,部分鳃丝发黑。组织病理学分析显示,相较于对照组,细菌感染后12 h,肝胰腺组织产生明显病变;鳃丝尖端出现肿胀,鳃丝排列不整齐,上皮细胞萎缩。溶藻弧菌感染能引起中华绒螯蟹肝胰腺和鳃组织损伤,其中感染后12～24 h是脏器损伤最严重的时间段。(3)酶活力检测结果显示,溶藻弧菌感染中华绒螯蟹后,肝胰腺组织中的溶菌酶(LZM)活力在6～48 h逐渐升高,48～72 h活力逐渐降低,均极显著高于对照组(P<0.01)。超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)活力在0～6 h逐渐上升,极显著高于对照组(P<0.01),6～12 h逐渐下降,12～24 h再次上升,24～72 h又逐渐下降,72 h恢复至接近对照组水平。蟹被感染后谷胱甘肽还原性酶(GR)总体呈现先下降后上升的趋势,碱性磷酸酶(AKP)呈现先降低后升高,再降低之后继续升高的变化趋势。上述结果证明,溶藻弧菌感染,激活了中华绒螯蟹肝胰腺组织免疫相关酶活性,引起了溶菌酶等免疫相关酶活性的变化。(4)将感染12 h内濒死易感个体定义为易感组(SIS),24 h内抗病存活个体定义为抗病组(ASX),以注射PBS组为对照组(CG)。每组随机采集各9只蟹,提取肝胰腺组织的RNA,定量后将随机三只等量均匀混为一个样本,进行高通量转录组测序。对所获得的Unigenes在NR、NT、KO、Swissprot、Pfam、GO、KOG七大数据库中进行注释,2.98%Unigenes在所有数据库中得到注释,45.25%Unigenes在至少一个数据库中获得注释,54.75%Unigenes在所有数据库中都没能得到注释。GO分析显示,21,633个Unigenes按分子功能、生物过程和细胞组分进行聚类;KOG分析,共有6,113个Unigenes被归类到26个功能类别中;7,870个Unigenes被映射到KEGG pathway数据库中。(5)共鉴定出10,547个差异表达基因(P<0.05)。其中,易感组(SIS)与对照组(CG)之间鉴定出6,232个差异表达基因(P<0.05),包括上调基因3,170个,如:抗脂多糖因子2、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等;下调基因3,062个,如:碱性磷酸酶、几丁质酶等。抗病组(ASX)与对照组(CG)之间鉴定出4,144个差异表达基因(P<0.05),包含上调基因1,670个,如:ADP-核苷酸化因子、clip结构域丝氨酸蛋白酶等;下调基因2,474个,如:谷胱甘肽S-转移酶Mu 1、羧肽酶B等。易感组(SIS)与抗病组(ASX)之间鉴定出6,104个差异表达基因(P<0.05),包含其中上调基因3,276个,如:B淋巴细胞瘤-2、NF-kappa B抑制剂α等;下调基因2,828个,如:磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、钙化酶等。对差异基因进行KEGG富集发现,发现其主要富集的通路有:MAPK信号传导通路、溶酶体、谷胱甘肽的代谢、PPAR信号传导途径等。(6)从鉴定出的差异基因中筛选出Arf、Laccases2、Bcl2等6个基因,进一步采用RT-q PCR技术对感染后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h的m RNA表达情况进行荧光定量分析。结果显示,以上基因在溶藻弧菌感染后的表达量均发生了显著变化,说明这些基因可能在中华绒螯蟹免Components of the Immune System疫调控方面有重要作用。综上所述,溶藻弧菌侵染中华绒螯蟹,会导致肝胰腺和鳃等组织损伤,引起溶菌酶等免疫相关酶活性的变化,以提高机体的抗氧化能力与免疫防御;同时,会导致不同临床症状的中华绒螯蟹肝胰腺组织转录组免疫相关基因差异性表达,进而提高机体免疫性能。