目的:通过临床观察独活寄生汤与依托度酸缓释片在治疗腰椎间盘突出症上的差异,明确独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症的临床疗效;通过临床取材髓核组织并提取髓核细胞,从分子水平探讨椎间盘退变的发病机理,阐明椎间盘退变与miR-223/JAK/STAT途径的相关性,并进一步探究独活寄生汤调控miR-223介导JAK/STAT信号通路减缓腰椎间盘退变的机制。方法:第一部分临床研究:回顾性分析2020年9月至2022年9月在我院骨科门诊治疗的162例腰椎间盘突出症患者,根据本研究的病例选择标准,分为独活寄生汤组(A组)和依托度酸缓释片组(B组),其中A组77例,B组85例,观察治疗前、治疗后1周、治疗后2周、治疗后4周的VAS评分、JOA评分、Oswestry功能障碍指数评分,评价独活寄生汤临床疗效及安全性。第二部分:本部分研究将临床取材的人腰椎间盘退变髓核组织和未退变髓核组织标本作为研究对象。(1)将手术中获取的髓核组织标本置于含20ml DMEM高糖培养液的50ml无菌离心管内,低温保存并于30min内送至实验室,进行髓核细胞分离、提取、培养,使用免疫荧光技术鉴定细胞。(2)qPCR检测退变与未退变髓核组织标本中miR-223、JAK/STAT各因子的表达。第三部分:本部分将研究髓核细胞中miR-223调控JAK/STAT信号通路的作用机制。(1)腰椎间盘髓核细胞作为研究对象,将第二部分中提取而来的髓核细胞进行复苏,传代至第二代,设置五组,分别是空白组,Mimic control转染组,miR-223 mimics转染组,Inhiselleckbitor control转染组,miR-223 Inhibitor转染组。细胞转染后,qPCR法检测STAT各因子的m RNA表达,用Western Blot检测p-JAK蛋白表达水平。(2)根据上述实验结果,构建STATx的慢病毒载体,观察NP细胞在LPS诱导的炎性环境中,miR-223调控JAK/STAT信号通路的具体机制。设置WT NP cells、control virus NP cells、STATx down-regulation NP cells三种细胞,每种细胞各设置六组,分别是空白组,LPS+未转染组,LPS+mimic control转染组,LPS+miR-223 mimics转染组,LPS+inhibitor control转染组,miR-223 inhiselleck合成bitor转染组。选用10μg/m L LPS处理NP细胞。使用qPCR法检测基因的表达水平,Western Blot检测蛋白表达量,ELISA法测定炎性水平,流式细胞术及Tunel染色检测细胞凋亡情况。集中观察miR-223干预JAK/STAT通路在LPS诱导的髓核细胞中调节细胞凋亡、炎性因子和基质降解酶表达以及细胞外基质合成中的作用机制。第四部分:本部分将腰椎间盘NP细胞作为研究对象。研究独活寄生汤干预髓核细胞后,miR-223/JAK/STAT途径及下游因子的变化,明确独活寄生汤在椎间盘髓核细胞中的作用机制。(1)制备独活寄生汤含药血清,建立LPS诱导的炎性NP细胞模型。研究分为四组,分别是:空白组(LPS+对照血清)、低剂量组(LPS+2%DXJS含药血清+8%胎牛血清)、中剂量组(LPS+5%DXJS含药血清+5%胎牛血清)、高剂量组(LPS+10%DXJS含药血清)。使用CCK-8法检测各组NP细胞的增殖情况,流式细胞术及Tunel染色检测各组NP细胞凋亡情况。(2)选择独活寄生汤含药血清最佳作用浓度,转染细胞,设置LPS+DXJS+mimic control转染组和LPS+DXJS+miR-223mimic转染组。使用CCK-8法检测转染后两组NP细胞的增殖情况,流式细胞术及Tunel染色检测转染后两组NP细胞凋亡情况。qPCR法检测基因的表达水平,Western Blot检测蛋白表达量。结果:第一部分临床研究:(1)在VAS评分方面,治疗前两组间VAS评分无显著差异(P=0.84),在治疗后1周、2周、4周两组患者VAS评分均显示有统计学差异(P<0.05),见表1-3。两组间治疗前后VAS各分值出现频率呈由大到小演变。两组间治疗前后VAS评分整体趋势呈由高向低递减变化。(2)在JOA评分方面,治疗前两组间JOA评Immunohistochemistry分无显著差异(P=0.61),在治疗后1周、2周、4周两组患者JOA评分均显示有统计学差异(P<0.05)。两组间治疗前后JOA各分值出现频率呈由小到大演变。两组间治疗前后JOA评分整体趋势呈由低向高递增变化。(3)在ODI方面,治疗前两组间ODI评分无显著差异(P=0.50),在治疗后1周、2周、4周两组患者ODI评分均显示有统计学差异(P<0.05)。两组间治疗前后ODI各分值出现频率呈由大到小演变。两组间治疗前后ODI评分整体趋势呈由高向低递减变化。(4)治疗后4周,A组有效率为74.03%,B组总有效率65.88%。第二部分:(1)免疫荧光检测可见细胞内同时有聚蛋白多糖和CollagenⅡ的存在,由此证明为NP细胞。(2)在退变椎间盘髓核组织miR-223表达明显高于未退变椎间盘髓核组织中miR-223的表达,且二者有显著性差异(P<0.01)。此表达水平差异性说明,椎间盘退变与miR-223有关。(3)与未退变髓核组织基因表达水平相比,退变髓核组织的Jak2(P<0.01)、Jak3(P<0.01)、stat1(P<0.01)、stat4(P<0.01)以及stat5B(P<0.05)m RNA表达显著增加;stat3(P<0.05)、stat5A(P<0.01)m RNA表达显著降低;Jak1、stat6以及stat2 m RNA表达无显著差异,同样,这种差异表明,Jak2、Jak3、stat1、stat4、stat5B与椎间盘退变具有相关性。第三部分:(1)qPCR检测NP细胞转染miR-223 mimics后,与空白组和Mimic control转染组相比,STAT1 m RNA表达量增加,NP细胞转染miR-223 Inhibitor后,与空白组和Inhibitor control转染组相比,STAT1和STAT6 m RNA表达量增加,其中STAT1增加幅度较STAT6要大。因此,根据qPCR实验结果,包装STAT1 sh RNA病毒和对照病毒进行后续实验。(2)miR-223-mimics显著增加了JAK2和STAT1的表达,miR-223抑制剂显著降低了JAK2的表达。这证明miR-223主要上调NP细胞中JAK2/STAT1的表达。(3)WB检测结果显示caspase-1,caspase-3在各样本中的表达情况:在control virus NP cells和WT NP cell中,LPS作用于两种细胞后,caspase-1,caspase-3的表达量均高于空白组,说明LPS可以刺激caspase-1,caspase-3在这两种细胞中的表达,LPS和miR-223 mimics共同作用于这两种细胞后,caspase-1,caspase-3的表达量均高于LPS组,说明miR-223 mimics可以刺激caspase-1,caspase-3在这两种细胞中的表达,LPS和miR-223 Inhibitor共同作用于两种细胞后caspase-1,caspase-3的表达量均低于LPS组,说明miR-223 Inhibitor可以抑制caspase-1,caspase-3在这两种细胞中的表达。在STATx down-regulation NP cells中,各组中caspase-1,caspase-3的表达量与空白组相比无明显变化。(4)在control virus NP cells和WT NP cell中,LPS作用于两种细胞后,凋亡细胞比例均高于空白组。第四部分:(1)采用CCK-8法结果显示,独活寄生汤浓度越高,NP细胞的活力越强,增殖能力越强;流式细胞术结果显示,独活寄生汤浓度越高,NP细胞的凋亡水平越低。(2)转染后,采用CCK-8法结果显示,miR-223减轻NP细胞活力,降低增殖水平;流式细胞术结果显示,miR-223增加NP细胞的凋亡水平。(3)转染后,qPCR结果显示,相较于LPS+DXJS+mimic control转染组,LPS+DXJS+miR-223mimic转染组miR-223表达显著增加(P<0.01);Caspase-1(P<0.01),Caspase-3(P<0.01),MMP3(P<0.01),MMP13(P<0.01),IL-6(P<0.01)和TNF-α(P<0.01)m RNA表达显著增加。(4)转染后,WB结果显示,相较于LPS+DXJS+mimic control转染组,LPS+DXJS+miR-223 mimic转染组p-JAK2、p-STAT1、Caspase-1、Caspase-3、MMP3、MMP13、IL-6和TNF-α蛋白表达显著增加(P<0.01)结论:(1)独活寄生汤可以明显缓解腰椎间盘突出症患者的疼痛、改善功能障碍、提高生存质量,与依托度酸缓释片相比,疗效更可靠。(2)miR-223/JAK2/STAT1途径在腰椎间盘退变病理进展中的发挥着重要的调节作用,是腰椎间盘退变发病和防治的重要途径。(3)独活寄生汤可以通过抑制miR-223/JAK2/STAT1途径,减轻腰椎间盘髓核细胞的炎症反应,减缓髓核细胞过度凋亡。