背景糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是一种常见的糖尿病微血管并发症,在发达国家已成为终末期肾病的首要病因。目前临床上DKD的治疗手段包括改善生活方式、积极控制血糖和血压等。这些方法可在一定程度上降低DKD患者的尿蛋白肌酐比,改善肾功能,但不能有效阻止其最终发展为终末期肾病。因此,有必要深入研究DKD发生发展过程中的肾脏病理机制,发掘有望成为治疗靶点的关键基因,以期寻找到新的有效的治疗策略。盐诱导激酶2(Salt-inducible kinase 2,SIK2),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。SIK2调控机体胰岛素分泌、脂肪合成等多条代谢途径,介导自噬、有丝分裂和内质网应激等生物过程,与肥胖、糖尿病、糖尿病视网膜病变、卵巢癌等疾病的发生密切相关。然而,目前尚未有关于SIK2在DKD中的作用的研究,SIK2是否参与肾功能的调节,是否影响DKD的发病进程等问题亟待阐明。本课题是首次针对SIK2在DKD中的作用及分子机制开展的研究。研究目的本研究旨在明确SIK2在DKD发展过程中的保护作用;探索SIK2抑制小管上皮细胞凋亡并改善肾小管损伤的分子机制;为DKD临床治疗提供新思路。研究方法1、构建1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)小鼠模型:(1)通过给C57BL/6雄鼠腹腔注射STZ构建T1DM小鼠模型,对照小鼠注射等剂量生理盐水。STZ 2周后小鼠空腹血糖>13.8m M,视为T1DM建模成功。(2)选择db/db鼠(BKS-Lepr~(-/-))作为T2DM小鼠模型,BKS-Lepr~(+/+)小鼠为对照小鼠,常规喂养。在STZ建模14周和db/db鼠20周龄时,两种小鼠已发生DKD,收集小鼠尿液、血清及肾脏样本。通过免疫组化、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)方法明确SIK2在小鼠肾脏表达位置及表达水平。2、以SIK2基因敲除(Knock out,KO)和野生型(Wild type,WT)小鼠为研究对象,通过腹腔注射STZ诱导DKD。分别评估两种基因型小鼠在非糖尿病肾病(N-DKD)和DKD条件下肾功能及小管损伤程度。具体方法如下:(1)检测血尿肾功能指标:经Jaffe比色法测定尿肌酐浓度,酶联免疫吸附方法测定尿中微量白蛋白浓度,计算小鼠尿微量白蛋白与肌酐比值(Urine microalbumin creatine ratio,UACR);利用比色法检测尿-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶排泄情况及血清尿素氮水平;(2)通过HE染色、Masson染色观察肾脏结构形态;(3)采用q RT-PCR检测TGF-1、COL1A1、COL4A1、IL-6、IL-1、TNF-等纤维化和炎症反应相关基因的表达水平;(4)免疫荧光染色检测肾小管功能标志物AQP1和肾小管损伤标志物NGAL表达水平;(5)TUNEL染色和Mito Sox染色检测肾脏细胞凋亡比例和活性氧水平;(6)利用透射电镜,观察小管上皮细胞内线粒体个数及形态,量化线粒体纵横轴比。3、利用小分子抑制剂ARN-3236抑制DKD小鼠体内SIK2激酶活性后,检测小鼠肾脏损伤情况。C57BL/6雄鼠经腹腔注射STZ诱导DKD。STZ建模10周时,匹配体重血糖后将小鼠分为对照组(STZ-Ctl)和SIK2酶活性抑制组(STZ-ARN)。STZ-ARN组小鼠口服小分子抑制剂ARN-3236,浓度为60mg/kg/day。ARN-3236处理21天后,评估小鼠肾功能及小管损伤情况,包括肾功能指标、形态学变化、小管功能标志物和损伤标志物表达水平、凋亡比例及肾间质纤维化水平等。具体检测手段同方法中第二点。4、选择人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK2)进行SIK2调控小管细胞凋亡的体外机制探索。利用转录组测序检测过表达SIK2后HK2细胞内基因表达变化,探索SIK2调节的下游通路及靶基因。转染过表达质粒或si-RNA片段从而过表达或敲低SIK2,通过q RT-PCR和WB对测序分析出的差异表达基因进行验证,利用流式检测HK2细胞凋亡比例。seahorse实验检测HK2细胞基础有氧呼吸和有氧呼吸峰值。结合测序结果和已有文献证据,分析SIK2调控细胞凋亡的分子通路。通过WB及免疫共沉淀检测SIK2与p300结合以及SIK2对热休克因子1(Heat shock factor 1,HSF1)磷酸化、乙酰化水平的调控,利用荧光素酶报告基因实验检测SIK2通过HSF1对HSPA6转录活性的调控。5、SIK2-WT和SIK2-KO小鼠经腹腔注射STZ诱导DKD,STZ 12周时,小鼠通过尾静脉注射腺相关重组病毒AAV9-pCDH16-HSF1或对照病毒AAV9-pCDH16,4周后评估小鼠(WT-C、KO-C、WT-HSF1和KO-HSF1)肾脏HSF1过表达效果及肾损伤情况。具体检测手段同方法中第二点。6、构建STZ和db/db两种DKD小鼠模型,每种小鼠再分为对照(STZ-C,db/db-C)和过表达SIK2组(STZ-SIK2,db/db-SIK2),在STZ建模10周和db/db鼠16周龄时,通过尾静脉注射AAV-pCDH-SIK2达到肾小管特异性过表达SIK2的目的。4周后评估小鼠肾脏SIK2过表达效果及肾功能水平。具体检测手段同方法中第二点。研究结果1、免疫组化染色结果表明SIK2主要在肾小管上皮细胞表达,肾小球内基本不表达。q RT-PCR和WB结果表明,相比于对照组,SIK2在STZ和db/db小鼠肾脏表达水平显著下降(P<0.05)。2、N-DKD条件下,WT和KO两组小鼠体重和空腹血糖无明显差异,两组小鼠肾功能正常,无蛋白尿,HE和Masson染色结果显示肾脏形态良好,肾小球结构完整,肾小管排列规则,无明显纤维化。但在DKD条件下,相比于WT-STZ组,KO-STZ组小鼠体重降低(P<0.05);空腹血糖无明显变化;尿微量白蛋白和-NAG排泄增加,BUN增加(P<0.05),提示KO-STZ小鼠肾小球滤过屏障和肾小管重吸收功能损伤加重。HE和Masson染色显示,相比于WT-STZ组,KO-STZ组小鼠肾小管损伤指数和间质纤维化百分比更高(P<0.05)。免疫荧光染色和q RT-PCR检测发现,KO-STZ组肾小管功能标志物AQP1表达降低,而损伤标志物NGAL表达增加(P<0.05),TGF-1、COL1A1、COL4A1、IL-6、IL-1、TNF-等参与纤维化和炎症反应信号通路的基因表达上调(P<0.05)。此外,TUNEL和Mito Sox染色表明,KO-STZ组小鼠肾小管上皮细胞凋亡比例和活性氧水平均高于WT-STZ组(P<0.05)。WT-STZ组肾小管上皮细胞内线粒体形态主要以肿胀为主,KO-STZ组线粒体变形严重,线粒体间存在融合,线粒体内发生嵴溶解,线粒体肿胀变圆。半定量统计发现KO-STZ组线粒体纵横轴比低于WT-STZ组(P<0.05)。3、相比于STZ-Ctl组,STZ-ARN组SIK2关键激酶活性位点(175位点)苏氨酸的磷酸化水平明显降低,说明STZ--ARN组小鼠SIK2激酶活性得到抑制。STZ-Ctl和STZ-ARN两组小鼠体重和空腹血糖无明显差异;然而STZ-ARN组小鼠尿微量白蛋白和-NAG排泄增加,BUN增加(P<0.05)。HE和Masson染色显示STZ-ARN组肾小管扩张、变形、小管内上皮细胞掉落等损伤现象更严重,间质纤维化比例更高(P<0.05)。与之相应,免疫荧光染色和q RT-PCR结果显示Sselleck化学TZ-ARN组AQP1表达降低,NGAL表达增加(P<0.05),TGF-1、COL1A1、COL4A1、IL-6、IL-1、TNF-等参与纤维化和炎症反应信号Barasertib作用通路的基因表达上调(P<0.05)。此外,SIK2激酶活性抑制后,STZ小鼠肾小管上皮细胞凋亡数目增加,线粒体变形加重,纵横轴比降低,活性氧产生增加(P<0.05),与前文SIK2敲除加重STZ小鼠肾功能障碍和小管细胞凋亡基本一致。4、GO和KEGG分析转录组测序结果发现,过表达SIK2后,HK2细胞内差异基因主要涉及细胞应激反应、细胞刺激反应、蛋白错误折叠等生物过程和内质网应激、蛋白酶体、贫血、军团菌病等代谢途径。利用Tg激活HK2细胞内质网应激反应。WB检测发现,过表达SIK2可降低e IF2磷酸化水平和CHOP表达;反之,敲低SIK2后,e IF2磷酸化水平和CHOP表达上调(P<0.05)。流式检测发现,相比于对照组,过表达SIK2后HK2细胞早期凋亡比例下调58.6%,敲低SIK2后HK2细胞早期凋亡比例增加61.4%(P<0.05)。此外,Seahorse结果提示,过表达SIK2后,HK2细胞线粒体有氧呼吸增强,反之敲低SIK2后细胞有氧呼吸减弱(P<0.05)。在牛磺熊脱氧胆酸抑制细胞内质网应激反应的条件下,敲低SIK2对细胞早期凋亡比例没有明显改变。5、进一步分析转录组测序得到的内质网应激通路相关的差异基因,我们发现过表达SIK2后可显著上调HSPA6的m RNA表达(P<0.05)。荧光素酶双报告基因结果提示SICadmium phytoremediationK2是利用其磷酸激酶活性,激活HSPA6的必需转录因子HSF1的转录活性,从而促进HSPA6的转录。相比于对照组,过表达SIK2后HSPA6表达上调,内质网应激标志物ATF4和CHOP表达降低,同时早期凋亡比例降低(P<0.05);然而,敲低HSF1条件下,过表达SIK2对内质网应激和细胞早期凋亡无明显影响,说明HSF1和HSPA6的缺失会部分削弱SIK2对内质网应激和细胞凋亡的抑制作用。SIK2对HSF1的磷酸化水平没有明显调节作用,然而过表达SIK2可以上调p300 Ser89位点磷酸化水平。通过免疫共沉淀证明了SIK2和p300分子存在相互结合,同时,SIK2可上调HSF1的乙酰化水平(P<0.05)。6、相比于对照组,转染AAV9-pCDH16-HSF1病毒后WT和KO鼠肾脏HSF1和HSPA6表达水平明显上调。特异性过表达HSF1对小鼠空腹血糖和体重无明显作用。相比于WT-C组,KO-C组小鼠UACR和尿-NAG排泄增加、肾小管硬化指数和间质纤维化比例增加、凋亡水平增加、肾小管损伤标志物表达升高(P<0.05);然而,WT-HSF1和KO-HSF1小鼠以上指标都无明显差异,说明过表达HSF1可部分弥补SIK2缺失引起的DKD小鼠肾损伤加重。7、相比于对照组,转染AAV9-pCDH16-SIK2病毒后DKD小鼠肾脏SIK2表达水平明显上调。相比于对照组,回复SIK2对DKD小鼠空腹血糖没有明显改变,但UACR和尿-NAG排泄减少,肾小管损伤标志物、炎症和纤维化相关基因表达降低(P<0.05)。更进一步,WB检测发现回复SIK2后,DKD小鼠肾脏HSPA6表达上调,同时内质网应激标志物ATF4、CHOP表达降低;TUNEL染色表明DKD小鼠回复SIK2后,肾小管上皮细胞凋亡比例减少(P<0.05)。此外,透射电镜观察以及Mito Sox检测结果显示,回复SIK2改善了DKD小鼠肾小管上皮细胞内线粒体形态和功能,具体表现为线粒体纵横轴比更长,活性氧产生较少(P<0.05)。结论本研究发现,SIK2主要表达在肾小管上皮细胞,在DKD小鼠肾脏表达水平显著降低。SIK2表达缺失或活性抑制会加重DKD小鼠的肾损伤进程,反之,肾小管特异性过表达SIK2可以削弱DKD小鼠肾小管损伤并改善肾功能。经过机制探索,发现SIK2通过抑制p300乙酰转移酶活性,从而上调转录因子HSF1的转录调控活性,继而上调HSPA6转录表达,并通过其对内质网应激的抑制作用减少肾小管上皮细胞凋亡。本研究为DKD治疗提供了新思路,特异性靶向过表达肾脏SIK2,可能成为DKD的治疗新策略。