酪氨酸激酶参与多种癌症的发生发展过程,并且以其为靶点的抑制剂类药物由于其相较于传统化疗药物所具有的突出疗效,近年来一直是药物研发的热点。但是经研究发现酪氨酸激酶抑制剂的使用表现出了许多不良反应包括心脏毒性,甚至会导致心力衰点击此处竭。伊马替尼(IMA)于2001年经FDA批准成为第一代小分子BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂,临床用于治疗慢性粒细胞白血病以及不可移除或已发生转移的胃间质实瘤。Kerkela等人在2006年首次系统地提出IMA会导致心脏毒性,在使用过程中应注意检测患者的心脏功能。因此,有必要去研究IMA导致心脏毒性的可能机制以及保护患者避免发生心脏毒性的药物。目前有关IMA所诱导的心脏毒性的发病机制包括内质网压力过载、氧化应激、细胞凋亡以及自噬等。铁死亡是一种不同于细胞凋亡和自噬的细胞调控死亡方式,其主要特征是细胞内铁离子的蓄积以致脂质过氧化物的堆积超过了以谷胱甘肽(GSH)为底物的磷脂氢过氧化物酶所维持的氧化还原能力。盐酸小檗碱(Ber)作为天然生物碱类物质,主要存在于黄连的根茎中,具有抗菌、抗炎、抗肿瘤以及心脏保护作用。目前为止,铁死亡是否参与IMA所致的心脏毒性以及Ber对IMA的保护作用机制是否与铁死亡有关还未见相关报道。本实验在前期研究中发现伊马替尼可以通过下调Nrf2信号通路诱发铁死亡从而导致心脏毒性,进而通过体内外实验探讨了Ber对IMA诱导心脏毒性的保护作用是否与Nrf2依赖性铁死亡相关。体外实验:在前期实验中用不同浓度的IMA溶液处理H9c2心肌细胞24 h,得到IMA对H9c2的IC_(50)为23.44μM,因此采用20μM IMA溶液处理24 h为模型组。将细胞一共分为6组:空白对照组(Control),模型组(IMA),Ber预处理组(10μM、20μM、40μM),铁死亡抑制剂组(Fer-1non-coding RNA biogenesis)。采用MTT实验探究Ber和IMA对细胞生长情况的影响,通过TMRE、DCFH-DA、Calcein-AM荧光探针分别检测H9c2细胞中线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS)、可变铁池(LIP)水平以及油红染色检测细胞中脂质沉积的情况。通过转染Nrf2质粒并且使用免疫荧光法检测细胞中Nrf2的表达水平。最后采用蛋白免疫印迹法(Western blot)来分析铁死亡相关蛋白的表达水平。体内实验:采用持续腹腔注射50 mg/kg剂量的IMA溶液14天建立IMA诱导的C57BL/6J小鼠心脏毒性模型。将小鼠随机分为6组,每组8只:空白对照组(Control),模型组(IMA),Ber低、中、高剂量组(分别提前2 h灌胃20 mg/kg/d、40 mg/kg/d、80 mg/kg/d的Ber溶液,2 h后腹腔注射50 mg/kg/d的IMA溶液),铁死亡抑制剂(Fer-1)组(提前2 h腹腔注射1 mg/kg/d的Fer-1溶液,2 h后腹腔注射50 mg/kg/d的IMA溶液)。给药完毕后,采用心电图(ECG)监测小鼠心脏功能,记录心电图波形,眼球取血并解剖小鼠,记录小鼠体重、心脏重量等参数。然后检测小鼠血清心肌酶谱水平并且采用HE染色、MASSON染色、油红O染色分别观察小鼠心脏组织的心肌损伤以及纤维化、脂质沉积情况;通过试剂盒检测丙二醛(MDA)、GSH、组织铁水平,并通过免疫组化和Western blot分析铁死亡关键蛋白GPX4,Nrf2信号通路以及铁死亡相关蛋白表达水平探究Ber对IMA所诱导心脏毒性的保护作用机制。细胞实验中,结果表明预先给与不同浓度的Ber溶液处理12h,均可以明显提高IMA溶液刺激下的H9c2细胞增殖活性,恢复心肌细胞线粒体膜电位并且降低胞内ROS、LIP和脂质沉积的水平。转染Nrf2目标质粒后,结果显示Nrf2表达水平明显上调,IMA可以显著降低Nrf2表达水平,Ber预处理可以上调Nrf2的表达。Western blot结果表明VX-765分子式,IMA可以降低Nrf2及其下游相关的抗氧化蛋白HO-1,NQO1,GPX4以及FTH1的表达,Ber预处理可以上调上述蛋白的表达,下调由IMA刺激所致上调的转铁蛋白受体Tf R和氧化应激相关蛋白P53的表达水平。动物实验中,ECG结果表明Ber可以改善心脏功能,并且与模型组相比,Ber组的小鼠体重、心脏重量有所增加。血清心肌酶谱结果表明Ber可以显著降低血清中心肌酶乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的水平;H&E染色结果显示Ber可以改善小鼠心肌损伤,减少心肌细胞空泡化病变;MASSON结果显示Ber可以抑制心脏组织发生纤维化病变;透射电镜结果表明,模型组小鼠心肌细胞线粒体膜发生破裂皱缩、嵴断裂或消失,符合铁死亡的典型特征,Ber可以显著改善线粒体的形态和线粒体功能;油红O染色结果表明Ber可以改善小鼠心脏脂质沉积;铁死亡相关生化指标分析结果表明Ber可以升高GSH的水平并且降低MDA以及组织铁的水平;对铁死亡代谢过程中的关键酶GPX4进行免疫组化结果显示Ber可以上调GPX4的水平;Western blot结果显示Ber可以上调Nrf2、HO-1,NQO1、GPX4以及FTH1的表达,同时下调白Tf R和P53的表达水平。综上所述,体内外的实验结果均表明Ber能够通过增加抗氧化、减少胞内游离铁离子的水平从而抑制Nrf2依赖性铁死亡来保护IMA导致的心脏毒性。