白屈菜(Chelidonium majus L.)为罂粟科(Papaveraceae)白屈菜属(Chelidonium L.)多年生草本植物,富含各类生物碱,具有明确的消炎止咳等药理活性。在植物生理学特性上,其具有极强耐寒、抗寒性,对耐寒抗寒研究及相关基因挖掘具有重要意义和价值。本实验室前期构建了白屈菜低温胁迫cell biology应答转录组数据库,通过筛选发现脂肪酸去饱和酶基因(Fatty acid desaturase,FAD2、FAD3)与类甜蛋白基因(Thanmatin-like protein,TLP)在低温胁迫下显著上调表达,表现出与耐寒、抗寒高度相关的生理功能。本研究通过异源转化拟南芥构建了转基因突变体At Cmfad2、At Cmfad3及At Cmtlp,旨在基于模式植物背景下深入研究和阐明白屈菜FAD2、FAD3和TLP基因的功能,特别是在冷冻胁迫时的基因表达特性和耐寒功能。拟南芥(Arabidopsis thaliana,(Col).)为转基因受体,目的基因Cm Ceralasertib浓度FAD2、Cm FAD3、Cm TLP来源于白屈菜,以生态型野生型拟南芥(Wt)为对照,对At Cmfad2、At Cmfad3及At Cmtlp突变体(T3)植株进行低温冷冻胁迫下基因表达特性分析、生理学研究、基于转录组的突变体耐寒机理研究、基于目的基因定位突变体耐寒机制解析4个方面的研究,解析白屈菜中FAD2、FAD3及TLP基因耐寒、抗寒生理功能。研究取得以下结果:1.基于荧光定量PCR方法,对不同温度胁迫下的目的基因表达特性分析发现,与野生型Wt相比,At Cmfad2、At Cmfad3及At Cmtlp突变体植株在各温度点均显著表达,其中冷冻阶段变化最显著。2.检测不同温度胁迫下野生型Wt及At Cmfad2、At Cmfad3、At Cmtlp突变体植株各项生理指标发现,与野生型相比,各突变体植株的相对电导率、丙二醛(MDA)含量均在低温冷冻胁迫下逐渐升高,脱CCRG 81045 MW驯化胁迫下含量降低。NBT和DAB染色均在冷冻阶段染色面积加大,颜色加深,脱驯化阶段染色面积减少,颜色变浅。叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均在低温冷冻阶段逐渐降低,脱驯化阶段恢复正常。类胡萝卜素、可溶性糖(SS)与游离脯氨酸(Pro)及可溶性蛋白(SP)在冷冻阶段含量显著增加,脱驯化阶段恢复正常。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均在冷冻阶段活性最高,而谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、多酚氧化酶(PPO)及抗坏血酸酶(APX)均在冷驯化阶段活性最高,脱驯化阶段活性降低。生长素(IAA)与脱落酸(ABA)在冷冻阶段含量最高,脱驯化阶段恢复正常,赤霉素(GA)随着温度降低含量逐渐减少,在冷冻阶段达到最低值,脱驯化阶段含量增加。可以看出Wt、At Cmtlp、At Cmfad2及At Cmfad3在低温、冷冻阶段的生理激素显著表达,且低温冷冻阶段生理及激素响应为At Cmtlp、At Cmfads>Wt,At Cmtlp>At Cmfads。3.对Wt、At Cmtlp在20℃、4℃及-40℃下处理的植株幼苗进行转录组测序发现,与Wt相比,At Cmtlp在各温度点的差异表达基因显著增加,且在冷冻阶段差异表达基因最多,表达变化率最大。GO富集分析显示差异基因主要富集到光合作用过程,对寒冷的反应,多糖代谢过程等,KEGG富集通路显示主要富集到植物激素信号转导、昼夜节律、淀粉和蔗糖代谢等过程。对低温冷冻阶段的差异表达基因筛选发现,显著上调的为信号转导、光合作用、植物激素、抗寒相关酶及蛋白、糖代谢相关通路,与前文生理及激素指标测定结果相符合。4.通过染色体步移方法检测突变体At Cmtlp、At Cmfad2及At Cmfad3中目的基因插入位点,结果发现,At Cmtlp插入到3个位点,与TLP原位点存在显著差异,插入位点分别为FKBP样蛋白、TBF相关因子13及肌凝蛋白结合蛋白;上游调控基因为GT2,F-box及DUF1685蛋白;下游调控基因为RING/U-box,α同种型诱导蛋白6及MYB60。At Cmfad2插入到1个位点,与FAD2原位点存在显著差异,插入位点为组氨酸激酶成员;上游调控基因为RING/U-box;下游调控基因为SCP1。At Cmfad3定位到2个位点,与FAD3原位点存在显著差异,定位位点分别为CDF5,ATMFP2;上游调控基因为MYB结构域蛋白,DIN3蛋白;下游调控基因为类同源结构域蛋白,富含氨基酸的家族蛋白。以上基因发现广泛参与并调控了植株的抗寒能力、生理激素的应答、形态发育、生命周期延长。由此可见At Cmtlp、At Cmfad2及At Cmfad3植株具有极强的抗寒能力以及显著的形态差异和生命周期特性与插入拟南芥的位置、上下游基因的调控作用具有极大的关系。