研究背景与目的FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3,FLT3)受体基因突变在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中发生率最高,约占全部初诊患者的30%。FLT3为III型跨膜受体酪氨酸激酶,在髓系及淋巴系细胞的早期发育阶段发挥十分重要的作用。FLT3受体基因突变分为两种类型,一种是发生于近膜区的内部串联重复突变(FLT3 internal tandem duplication,FLT3-ITD),约占初诊AML患者25%;另一种是发生于酪氨酸激酶区的点突变(FLT3 tyrosine kinase domain mutations,FLT3-TKD),在初诊AML患者中发生率约为5%~10%。FLT3-TKD突变对AML的预后无明显影响,而FLT3-ITD突变为AML的不良预后分子标志之一。与无突变患者相比,FLT3-ITD突变患者外周血白细胞高、诱导化疗缓解率低、无复发生存率与总生存率均显著降低。如果仅采用化疗巩固,FLT3-ITD突变AML患者3年存活率小于30%。异基因造血干细胞移植是否能够克服FLT3-ITD突变的不PF-6463922良预后目前仍存在争议。近年上市的FLT3受体抑制剂在此类AML的治疗中虽取得一定进展,但整体疗效改善有限,且耐药是影响抑制剂临床应用的瓶颈所在。因此,开发FLT3-ITD突变AML新的治疗药物具有迫切的临床需求。FLT3-ITD突变导致受体酪氨酸激酶信号的持续激活,进而可活化一系列下游信号传导通路,如MEK/ERK与PI3K/AKT等,后者可激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)。NF-κB的活化与入核后可显著上调微小RNA155(micro RNA-155,mi R-155)的表达,后者可抑制多种髓系分化转录因子的表达,包括CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding proteinα,CEBPα)、PU序列结合转录因子(PU.1)与含SH2肌醇5磷酸酶1(SH2-containing inositol 5-phosphatase 1,SHIP-1),从而导Panobinostat抑制剂致白血病细胞恶性增殖并伴分化受阻。采用特异性抑制剂阻断NF-κB的活化与入核可显著抑制FLT3-ITD突变AML细胞的体内外增殖,并可下调mi R-155表达,上调CEBPα、PU.1与SHIP-1的表达。因此,阻断NF-κB/mi R-155通路是FLT3-ITD突变AML的潜在治疗靶点。中药单体药物紫草素(shikonin,SHK)具有抗肿瘤、抗炎症、抗过敏等多种生物学功能。有文献报道SHK不仅对多种受体与非受体酪氨酸激酶活性具有抑制作用,而且抑制NF-κB信号通路是SHK发挥功能的主要机制之一。尽管有多项研究报道了SHK的抗白血病效应,但其对何种类型白血病细胞更为敏感目前并不清楚。白血病包括急性白血病与慢性白血病,前者包括AML与急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL),后者包括慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)与慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia,CLL)。酪氨酸激酶抑制剂的出现使CML患者的预后得到显著改善,CLL早期无需治疗,具有治疗指征的患者经化疗或intracameral antibiotics免疫化疗等治疗后预后较好。ALL多见于儿童,治疗效果相对较好。AML是成人最常见白血病,目前治疗疗效仍不理想,特别是高危组AML患者。本研究旨在通过不同类型AML细胞筛选以确定SHK对FLT3-ITD突变AML细胞的敏感性及其潜在分子机制,进而为开发抗FLT3-ITD突变AML单体中药提供理论依据与前期数据。方法采用不同类型人源AML细胞系,给予SHK处理,经CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,确定不同SHK对不同类型AML的半数抑制浓度(IC50)及诱导凋亡率。采用FLT3-ITD突变细胞系MV4-11细胞与MOLM-13细胞,给予SHK处理,western blotting检测caspase-3、cleaved caspase-3、FLT3、p-FLT3、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、CEBPα、SHIP-1、PU.1的表达水平,q PCR检测mi R-155水平,流式细胞仪检测细胞分化情况,免疫荧光检测NF-κB p65亚基的激活及入核情况。转录组学探索SHK对FLT3-ITD突变AML细胞作用的潜在分子机制。结果1.不同类型AML细胞经SHK作用24~72 h后,结果显示FLT3-ITD突变AML细胞的IC50明显低于无FLT3-ITD突变患者。SHK处理不同类型AML细胞48小时后,FLT3-ITD突变AML细胞的凋亡率明显高于无突变细胞。采用MV4-11细胞构建白血病动物模型,结果显示SHK可明显抑制FLT3-ITD突变AML细胞的体内增殖。2.FLT3-ITD突变AML细胞MV4-11经SHK处理24 h后,FLT3受体蛋白活化明显受抑,下游信号分子AKT与ERK的活化均明显受抑;分子对接显示SHK可直接作用于FLT3受体蛋白的特殊分子口袋中,SHK通过与FLT3受体第574位的丝氨酸、第592位的缬氨酸和第658位的丙氨酸形成氢键来共价结合。3.SHK可阻断NF-κB p65亚基的入核,下调mi R-155表达,上调髓系分化相关转录因子CEBPα、SHIP-1与PU.1的表达;低剂量SHK处理MV4-11细胞后,白血病细胞会出现向单核细胞分化趋势。4.转录组学研究结果显示SHK处理MV4-11细胞后,出现21个差异表达基因,16个表达下调,5个表达上调;KEGG富集分析显示SHK主要调控的信号通路包括PI3K/AKT通路、细胞外基质与受体相互作用通路、细胞黏附通路、ERK通路;蛋白互作分析SHK可下调多种细胞与细胞外基质相互作用蛋白。结论SHK对FLT3-ITD突变AML细胞具有选择性增殖抑制与促凋亡作用,SHK可明显抑制FLT3-ITD突变AML细胞的体内增殖。SHK可明显抑制FLT3受体酪氨酸活性及其下游信号传导通路,其机制可能为SHK与FLT3受体蛋白存在相互作用。SHK可抑制NF-κB激活与入核,下调mi R-155表达,上调髓系相关转录因子表达,进而促进FLT3-ITD突变AML细胞向单核细胞分化。转录组检测结果提示尚有其他机制有待验证与探索。