目的:研究赶黄草富乔松Surgical intensive care medicine素没食子酸衍生物部位(PGF)对MRL/lpr小鼠的干预作用,运用网络药理学方法预测、并结合体外实验验证赶黄草PGF部位干预系统性红斑狼疮(SLE)的分子作用机制。方法:1.动物学实验:(1)以MRL/lpr狼疮样小鼠为研究对象,将小鼠分为模型组、西药组(PAT组)和PGF给药组,以MRL/MPJ小鼠为空白对照;(2)尿蛋白检测:分别在灌胃的第4周和第6周收集尿液样品,通过考马斯亮蓝试剂盒检测尿蛋白含量;(3)通过眼球取血,一部分血液进行血常规检测,另一部分血清通过流式或ELISA试剂盒对细胞因子、抗核抗体进行检测;(4)在小鼠处死前称取体重,解剖后分别称取小鼠胸腺、脾脏重量(g),计算脾脏/胸腺指数;(5)通过H&E、PAS和Masson法对小鼠肾脏进行病理染色分析。2.网络药理学:(1)通过文献检索和前期研究结果获取PGF的特征活性成分,并预测其靶点。通过GEO数据库及OMIM、PharmGKB等五个在线疾病数据库收集SLE的疾病靶点。(2)将疾病靶点和成分靶点进行交集,取其共同作用靶点进行PPI核心网络靶点分析,并对其进行GO功能分析及KEGG通路分析。(3)根据KEGG结果选取相关IDN-6556纯度靶点与PGF的特征化合物分别进行分子对接,验证其亲和力。3.细胞学实验:(1)制备PGF提取药物及PGF大鼠含药血清。(2)以HK-2细胞为研究对象,通过MTT实验确定PGF提取物、H2O2浓度、含PGF血清的安全用药浓度。(3)以293T细胞为研究对象,通过双萤光素酶报告基因检测PGF对抗氧化反应元件ARE的转录水平的影响。(4)以HK-2细胞和239T细胞为研究对象,通过Western-blot和RT-PCR实验来检测含PGF血清(7.5%和10%浓度)对HIF-1α、TLR4、NF-κB及其磷酸化的蛋白和mRNA表达水平的作用;以HepG2细胞为研究对象,通过 Western-blot 实验来检测 PGF 提取物(10、20、40μg/mL)对 HIF-1α、NF-κB蛋白表达水平的作用。(5)以狼疮小鼠的淋巴结和脾脏原代细胞为研究对象,通过RT-PCR实验来检测含PGF血清(7.5%和10%浓度)对HIF-1α、TLR4及NF-κB的mRNA的表达水平的影响。结果:1.动物学实验:与模型组相比,PGF组及西药组(PAT)脾脏/胸腺指数、血液中的白细胞和中性粒细胞均有不同程度的降低,血清中抗dsDNA抗体和抗snRNP/Sm抗体的含量也有显著降低(P<0.05);血清中的IL-12、IFN和TNF-α的浓度显著降低(P<0.05)。通过病理染色观察发现,与空白组相比,模型组小鼠肾脏内肾小球及其周围组织炎性细胞浸润增多、肾小球内系膜及基底膜严重增生、肾脏内组织纤维化程度高;而PAT和PGF组的小鼠较模型组有所改善。说明赶黄草PGF和PAT处理可以改善MRL/lpr小鼠的狼疮样损伤。2.网络药理学:(1)一共收集到20个PGF特征活性成分,通过数据库预测成分和疾病的靶点后,取其交集后发现PGF与SLE共同作用于143个靶点。(2)将PGF与SLE共同作用靶点进行PPI核心网络分析、GO功能和KEGG通路分析,结果发现PGF防治SLE作用机制的功能分析主要富集在对缺氧、免疫、炎症反应等方面;通过KEGG通路富集分析发现PGF防治SLE主要富集在癌症、氧化应激(HIF-1)及炎症(NF-κB、TLR4)等相关通路。(3)根据前面通路分析结果,进行分子对接结果发现PGF的特征化合物S2、S3与HIF-1α、NF-κB、TLR4三个蛋白的结合能均小于7 kcal/mol,说明其结合性较好。因此进一步验证PGF可能是基于HIF-1α/NF-κB/TLR4通路防治SLE。3.细胞学实验:(1)MTT实验结果显示:以HK-2细胞为研究对象,实验发现含PGF血清(浓度在2.5%到15%范围内)对细胞无明显毒性;但PGF提取物在浓度超过40μg/mL时,开始表现出显著的细胞毒性;(2)双萤光素酶报告基因实验显示:PGF处理可以增加293T细胞内的抗氧化元件ARE的转录,且PGF还可以解除H2O2处理对ARE的抑制作用。(3)Western-blot实验显示:以LPS处理的293T及HK-2细胞为模型研究发现PGF可以显著抑制LPS处理激活的HIF-1α、TLR4及NF-κB的过度表达。(4)实时荧光定量PCR(real time-PCR)实验显示:低、高剂量的PGF处理均显著抑制了 LPS刺激HK-2细胞后,HIF-1α、NF-κB和TLR4的转录表达。但是该活性在293T细胞中不显著。(5)通过real time-PCR实验显示:PGF部位能够显著抑制MRL/lpr小鼠的脾脏原代细胞中HIF-1α、NF-κB和TLR4的转录表达,其中低剂量效果能显著;但仅能抑制淋巴结原代细胞中TLR4的转录表达。结论:1.PGF能够显著降低MRL/lpr小鼠的脾脏/胸腺指数、减少血清促炎细胞因子、降低狼疮小鼠的尿蛋白含量、减轻MRL/lpr小鼠肾小球及其周围组织的炎性浸润、纤维化增生。2.PGF能够通过抗炎、抗氧化、调节免疫等方面缓解SLE肾损伤。3.PGF能够激活抗氧化元件ARE的转录,抑制HIF-1α、TLR4和NF-κB的转录和翻译,以及NF-κB的磷酸化的修https://www.selleck.cn/products/PLX-4032.html饰。