食源性微生物污染是致使每年数千万人患病或死亡的重要原因之一。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等目前流行食源性致病菌在食源性微生物污染中占比最高。现有的检测技术对时间和技术人员操作能力的要求较高,无法满足当下食品快速检测的需求。此外,抗生素的滥用致使一些耐药性食源性病菌的产生,这对食源性致病菌的杀灭技术提出了更高的要求。近年selleck CX-5461来,纳米酶凭借优异的催化能力与稳定的性能结构成为抗菌领域的热点材料。本文设计了一种具有级联催化能力(葡萄糖氧化酶-类过氧化物酶)的新型纳米酶GGFzyme,能催化底物葡萄糖生成活性氧,活性氧通过氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺实现葡萄糖浓度和实际样品中的食源性致病菌活性的快速检测。同时催化产生大量活性氧让GGFzyme纳米酶展现出优异的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀灭能力。该纳米酶可有获悉更多效提高检测和杀灭食源性致病菌的效率。论文的主要研究内容如下:1.GGFzyme纳米酶的合成及其级联催化活性采用水热法制备GGFzyme,通过扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)观察到材料的形貌呈椭球形且分布均匀,纳米激光粒度仪确定材料的粒径大小在20～50 nm。傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、X射线光电子能谱(XPS)以及能谱分析(SEM-EDS)等方法确定了各元素在合成材料内的分布和价键情况,同时证实了材料的成功合成。在体系中未添加过氧化氢(H_2O_2)的情况下,纳米酶GGFzyme能以葡萄糖为底物生成使显色底物TMB氧化的自由基,表明GGFzyme纳米酶具有葡萄糖氧化酶和类过氧化物酶催化能力。通过设置梯度对催化反应条件进行优化,得出GGFzyme纳米酶的最优反应温度为37°C,最佳p H=4.0,反应时间为30 min。GGFzyme纳米酶的合成方法简便且不需繁复仪器,在较宽温度和p H范围内具有较高的检测精度,较好的催化活性和稳定的结构。2.基于GGFzyme纳米酶级联催化食源性病菌检测以GGFzyme纳米酶级联催化为手段,利用食源性致病菌代谢过程对葡萄糖的消耗,构建食源性致病菌活性的快速检测方法。结果表明当体系中葡萄糖浓度在1～500μM之间时葡萄糖与吸光度值存在良好的线性关系(R~2=0.993),最低检测限(LOD)为0.43μM。本章中验证了GGFzyme纳米酶对底物具有良好的特异性,使得能通过吸光度值对未知浓度体系中的葡萄糖进行定量检测。实际样品测试中以苹果汁为检测对象,在对苹果汁进行预处理后,测定苹果汁中的吸光度值并计算出苹果汁中葡萄糖的含量。利用食源性致病菌生长繁殖会消耗葡萄糖的原理检测食源性致病菌污染前后的吸光度值变化,在本试验中能检测出浓度为10~7 CFU m L~(-1)的大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、单增李斯特菌(L.monocytogenes)和阪崎肠杆菌(E.sakazalii)等5种常见食源性致病菌。3.基于GGtranscutaneous immunizationFzyme纳米酶级联催化MRSA高效杀灭以葡萄糖触发的GGFzyme纳米酶级联催化产生的自由基为杀菌成分,对MRSA进行绿色高效杀菌。首先采用平板涂布法明确了GGFzyme纳米酶对MRSA的杀菌能力,结果表明材料在30 min内对10~7 CFU m L~(-1)细菌浓度的杀菌率高达99.4%。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化丙啶(PI)荧光图像结果也显示MRSA会在葡萄糖和GGFzyme纳米酶的共同作用下大量死亡。通过观测扫描电镜探究GGFzyme纳米酶的杀菌机制,结果表明GGFzyme纳米酶催化产生的自由基破坏了耐药性食源性致病菌的细胞膜,导致细胞膜严重破损和细胞内容物质流出。通过电子自旋共振(ESR)确认生成自由基的种类为羟基自由基和超氧阴离子,导致自由基能破坏食源性致病菌的膜结构,影响细菌的代谢过程从而杀灭食源性致病菌。同时结合MTT细胞体外毒性实验和小鼠器官切片等手段,表明了GGFzyme纳米酶具有良好的生物安全性,为后续在食品领域深入开展食源性致病菌的杀灭研究奠定了坚实的基础。