研究背景周围神经损伤(Peripheral nerve injury PNI)是一种严重的临床疾病,好发于青壮年。它的特点是发病率高,治疗方法有限,临床预后差。严重的周围神经损伤是导致永久性功能障碍和发病的主要原因之一,给社会带来了沉重的医疗和经济负担。当PNI发生时,首先会触发一系列的细胞和分子事件,称为Waller变性;随后,增殖的巨噬细胞被激活,并被招募到损伤处以去除髓鞘碎片和坏死组织,最终启动神经再生程序。然而,过度的炎症反应会导致组织局部活性氧(reactive oxygen species ROS)水平的升高。巨噬细胞是产生ROS的主要来源之一,它在吞噬炎性坏死组织的同时会产生大量的ROS,而ROS的过度积累会引起氧化应激反应,产生神经毒性作用,使周围神经细胞损伤,抑制周围神经再生修复。由此可见,如何有效调节损伤部位的炎症反应和氧化应激是促进周围神经再生和功能恢复的关键。近年来,越来越多的研究者将目光集中于开发和设计医用高分子材料用于促进神经组织的再生和受损神经功能的恢复,取得了一些重要进展。其中,水凝胶由于独特的理化性质,常被用作神经源性细胞培养和增殖的支架材料。然而,常规的水凝胶材料缺少调控炎症微环境的能力,限制了其在PNI治疗中的应用,为此,我们开发了一种以单宁酸为交联剂的透明质酸基动态多功能水凝胶,并探讨其通过消除损伤部位ROS和调控炎症微环境促进周围神经修复(Peripheral nerve repair PNR)的治疗效果和作用机制。研究目的:本研究系列实验主要围绕以单宁酸(tannic acid,TA)为交联剂的透明质酸基动态多功能水凝胶用于PNI的修复展开探索。首先以TA作为交联剂构建了的具有抗氧化应激、抗炎能力的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)基多功能水凝胶(HPTA)。充分表征了构成水凝胶确认细节的前体与水凝胶的理化性质,以及探究其在细胞实验中对细胞行为的影响,然后将水凝胶注射到大鼠坐骨神经挤压伤处进行治疗用于评估HPTA水凝胶对神经损伤修复的效果。随后我们在成功构建HPTA水凝胶的基础上,在水凝胶中负载甲钴胺(MethylcobalamPanobinostatin,MeCbl),开发出一种新型的可注射HPTA@MeCbl水凝胶用于替代MeCbl传统的注射疗法,可以在神经损伤局部进行持续治疗。对HPTA@MeCbl水凝胶的理化性质进行充分的表征用于验证MeCbl的加入是否会改变HPTA凝胶本身的性质。通过体外细胞实验与体内对大鼠坐骨神经横断伤的治疗所得到的结果用于评价HPTA@MeCbl水凝胶对神经再生的影响。研究方法:本研究首先构建了具有抗氧化、抗炎功能的HPTA水凝胶。对其理化性质进行充分表征,通过体外细胞实验探究水凝胶对细胞行为的影响,最后将水凝胶应用于大鼠坐骨神经挤压伤模型以验证其对大鼠坐骨神经再生与功能恢复的作用。具体研究方法如下:(1)首先利用3-氨基苯硼酸(3-Aminophenylboronic Acid,3-APBA)上的氨基(-NH2),与HA上的羧基(-COOH)进行酰胺化反应,将3-APBA接枝到HA上形成HA-PBA偶联物。对HA-PBA进行傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)表征后,以TA为交联剂与HA-PBA偶联物进行共混合成含有动态硼酸酯键的HA基水凝胶(HPTA)。对HPTA水凝胶进行形貌、流变学、粘附性、降解速率及药物释放性能等方面进行表征并筛选出最佳的水凝胶浓度。然后通过DPPH·、PTIO·自由基清除效率验证水凝胶的抗氧化能力。(2)体外细胞实验表征了HPTA水凝胶对嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,PC12)细胞与雪旺细胞(Schwann cells,SCs)的细胞行为的影响。并探究了HPTA水凝胶在高ROS条件下对细胞的保护作用。(3)体内动物实验利用大鼠坐骨神经挤压伤模型对该水凝胶的神经修复效果进行评价。将所有大鼠随机分组后进行造模,然后在术后2周与4周时通过大鼠的足印分析、神经电生理学测试、肌肉组织学分析、神经组织学评价、免疫蛋白荧光、免疫蛋白印迹及神经组织的炎症因子表达来评估大鼠下肢功能恢复效果并进一步探讨HPTA水凝胶对神经修复的影响。随后,我们在成功构建HPTA水凝胶的基础上加入甲钴胺(MeCbl),开发出新型的HPTA@MeCbl水凝胶。(1)先对HPTA@MeCbl水凝胶进行形态学、流变学、粘附性、体内、外降解性、MeCbl的释放等方面的表征,并将获得的结果与空白对照(HPTA)组进行对比。(2)在体外使用PC12细胞进行细胞活力、增殖、细胞活死染色等实验验证其细胞相容性。(3)最后,我们将HPTA@MeCbl水凝胶应用于大鼠坐骨神经横断伤的治疗。术后2个月时进行大鼠的足印分析、神经电生理Cadmium phytoremediation学测试、肌肉组织学分析、神经组织学评价、免疫蛋白染色等一系列实验来评价下肢功能恢复与坐骨神经再生情况。研究结果与结论:(1)本研究首先通过500 MHz氢谱质子核磁(1H NMR spectra)对HAPBA偶联物进行信息采集,图上的多重峰表明了苯硼酸基团成功地修饰到了透明质酸的分子链,并计算得到接枝率为:23.4%。合成HPTA水凝胶后,通过红外光谱分析(FTIR)可知位于1326 cm~(-1)处的特征峰主要归因于硼酸酯键(BOH)的拉伸震动,证明TA与HA-PBA偶联物成功交联形成水凝胶网络。随后对HPTA水凝胶的形貌、储能模量、粘附性、降解速率及释放性能进行表征,筛选出HPTA-3为最优的成胶浓度,并继续后续实验。当HPTA-3水凝胶在浓度为20mg/m L时,对DPPH·与PTIO·的自由基清除率分别达到(76.23±0.75%)与(66.95±0.13%),证实了HPTA-3优异的抗氧化能力。(2)随后在细胞实验中,HPTA-3水凝胶的抗氧化能力同样得到了体现。我们使用20mg/m L的HPTA-3水凝胶提取液与0.5m M的H_2O_2溶液混合后共孵育PC12细胞,细胞活力均大于80%,也说明了HPTA-3水凝胶可以有效消除细胞内ROS,以此来达到保护细胞免受ROS伤害的作用。体内降解实验的结果显示,在术后4周水凝胶附近的皮肤组织均未出现明显的炎症反应,说明HPTA-3水凝胶具有良好的体内生物安全性。体内动物实验通过步态分析、坐骨神经指数(SFI)、神经电生理测试、肌肉组织学、神经组织学、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)下观察的轴突直径与髓鞘厚度,以及4种特异性蛋白染色、ELISA法炎症因子表达和免疫蛋白印迹等实验结果证明了虽然HPTA-3治疗组与Sham组相比结果仍有差距,但相比于未进行水凝胶治疗的Crush组则取得了更好的结果。并且ELISA法测定神经组织的趋化因子,证明应用HPTA-3水凝胶可以上调抗炎因子水平并抑制促炎因子的表达,可以帮助神经组织损伤后巨噬细胞从M1表型向M2表型转型,也证实了HPTA-3的抗炎特性。通过对MBP与NF200的免疫蛋白印迹表达结果与免疫蛋白荧光染色相对应,再次证明了HPTA-3水凝胶可以有效地促进损伤后神经轴突的再髓鞘化及轴突再生。随后我们进一步在HPTA水凝胶基础上负载MeCbl合成可注射的HPTA@MeCbl水凝胶。(1)首先通过SEM对HPTA@MeCbl水凝胶进行微观形貌的观察可以发现MeCbl结晶沉积在水凝胶的网络结构中。然后我们对HPTA@MeCbl水凝胶进行了流变学、粘附性、降解性等一系列表征,并与未负载MeCbl的空白HPTA组进行对比,发现两组水凝胶在材料表征结果上并无显著差别,因此也说明MeCbl的加入对凝胶的交联度与硼酸酯键的形成没有干扰,不会对水凝胶的理化性质造成实质性改变。随后我们通过标准曲线回归方程:y=181.94x-0.1471对MeCbl的释放率进行计算,释放率在前6天增长快速,6-10天则明显放缓,HPTA@MeCbl水凝胶的这种释放规律有望在早期达到治疗所需浓度,可以更早地帮助受损神经进行修复。(2)我们通过细胞实验也证明HPTA@MeCbl水凝胶具有良好的细胞相容性,并且在与细胞共孵育48小时后可以观察到有明显的促进细胞增殖的作用。(3)最后将HPTA@MeCbl水凝胶进行坐骨神经横断伤的治疗。结果表明,与空白的HPTA组和Transection组相比HPTA@MeCbl组的结果更接近Sham组,治疗效果更好。值得注意的是术后2个月时NF200、Tuj-1的特异性蛋白染色的半定量分析结果显示HPTA@MeCbl组与Sham组的结果比较无统计学差异,也证明了HPTA@MeCbl水凝胶可以使神经轴突的再生效果明显提高,能够恢复到类似于正常神经组织的结果。综上所述,本研究成功构建了以TA作为交联剂的HA基动态多功能水凝胶,在未与其他治疗剂联合使用的情况下,HPTA水凝胶凭借自身抗氧化、抗炎作用可有效促进PNI后的神经修复。并且作为药物的递送载体,实现了MeCbl在神经组织损伤局部的持续性治疗,验证了这种“经典药物新用法”的可行性,对未来高性能神经损伤修复材料的设计和开发提供了新的思路与方向。