肺癌在世界范围内发病率和死亡率都位居前列,是最常见的恶性肿瘤之一。肺癌的发生发展与免疫调节,炎性浸润有着很重要的关系。昼夜节律是指机体持续约24小时的内源性生物行为周期,对免疫功能具有正面和负面的影响。临床调查显示昼夜节律紊乱容易导致机体免疫稳态失衡,增大机体炎症反应甚至是癌症发生的概率。酸枣仁,是鼠李科植物酸枣的种子,是一味治疗失眠难寐,烦Adezmapimod躁焦虑的经典中药。酸枣仁皂苷是酸枣仁的主要成分,具有镇静催眠,抗炎抗氧化,提高免疫,抗癌的作用。因此本文基于昼夜节律紊乱对机体的影响作用,从肺癌发病因素方面入手,探讨昼夜节律紊乱对肺癌的影响以及酸枣仁皂苷通过调节昼夜节律紊乱对肺癌的改善作用。首先我们探讨昼夜节律紊乱对肺癌的影响作用。我们先后建立了三个动物模型,即使用对氯苯丙氨酸(PCPA)建立睡眠障碍型昼夜节律紊乱模型,使用香烟烟雾联合乌拉坦建立肺癌模型,然后使用对氯苯丙氨酸联合香烟烟雾以及乌拉坦建立昼SCH772984纯度夜节律紊乱合并肺癌模型。对三个模型分别以酸枣仁皂苷高中低三个剂量灌胃给药,检测小鼠一般体征。使用戊巴比妥钠睡眠实验以及松果体细胞HE染色,检测睡眠障碍型昼夜节律紊乱模型的建立以及酸枣仁皂苷对昼夜节律紊乱的调节作用;使用小动物能量代谢仪系统检测小鼠肺通气量变化、小动物活体成像技术检测小鼠肿瘤生长情况、HE染色检测小鼠肺部病理结构来验证肺癌模型、昼夜节律紊乱合并肺癌模型的建立。根据小鼠静息代谢,荧光染料IR783在肿瘤部位聚集的荧光强度、肺组织表面病变情况以及HE染色病理切片,免疫印迹法(Western Blot)检测肺组织中血管内皮生长因子(VEGF),增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的情况等,评估昼夜节律紊乱对肺癌模型小鼠肿瘤生长的影响以及酸枣仁皂苷调节昼夜节律紊乱对肺癌的改善。然后我们探讨了昼夜节律紊乱促进肺癌发展的原因。我们使用碳粒廓清以及溶血空斑实验评估昼夜节律紊乱对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力,体液免疫的影响;使用血常规检测小鼠外周血细胞数量,ELISA检测小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6,IL-1β,TNF-α,评估昼夜节律紊乱对正常小鼠炎性细胞和炎性因子表达的影响;而后用宿主抗异种移植瘤实验评价昼夜节律紊乱对正常小鼠整体免疫水平的影响。根据小鼠腹腔巨噬细胞碳粒吞噬指数、溶血空斑生成量,外周血炎症细胞数目,血清和肺泡灌洗液中IL-6,IL-1β,TNF-α炎性因子表达量,异种移植瘤生长情况评价昼夜节律紊乱对小鼠的影响以及酸枣仁皂苷调节昼夜节律对小鼠的改善作用。最后我们探讨酸枣仁皂苷调节昼夜节律紊乱的机制。我们使用网络药理学、分子对接技术预测酸枣仁皂苷调节昼夜节律紊乱的graphene-based biosensors生物功能作用以及相关作用通路;使用T/B淋巴细胞增殖实验,荧光探针DCFH-DA检测小鼠脾细胞ROS以及Western Blot实验检测小鼠脾组织IL-6,STAT3的表达情况来验证网络药理学预测结果。在评估昼夜节律紊乱对肺癌小鼠中的作用以及药物改善情况的研究中,通过戊巴比妥钠睡眠实验和松果体病理切片,我们发现昼夜节律紊乱模型小鼠相较于对照组睡眠潜伏期变长,睡眠持续时间缩短,松果体细胞排列分布紊乱,细胞核固缩,细胞数量明显减少,空泡性增多。酸枣仁皂苷给药后,昼夜节律紊乱模型小鼠睡眠潜伏期变短,睡眠持续时间变长,松果体细胞间隙变小,细胞数量增加,说明酸枣仁皂苷对昼夜节律紊乱有调节作用;通过静息代谢,小动物活体成像实验,我们发现肺癌模型小鼠以及昼夜节律紊乱合并肺癌模型小鼠潮气量均下降30%以上,肺部区域有大面积肿瘤荧光成像;通过小鼠肺部病变照片,HE染色,免疫印迹实验,我们发现,与肺癌模型小鼠对比,昼夜节律紊乱合并肺癌模型小鼠第五周时肺部充血水肿严重,肺部大量炎性细胞浸润,肺损伤严重,第十周时肺部有大量肿瘤结节,且肺叶严重充血变形;HE染色后,昼夜节律紊乱合并肺癌模型小鼠肺部肿瘤病灶面积更大,肺泡壁增厚,肺泡壁间隔断裂明显,肺泡塌陷严重,PCNA,VEGF蛋白高度表达,说明昼夜节律紊乱加剧肺部炎性浸润,增大肺损伤程度,加重肺癌的恶化。在肺癌模型中,酸枣仁皂苷对提高小鼠自主活动、肺通气量,降低小鼠肺部荧光强度,减少炎性浸润、肿瘤结节数,修复肺损伤,改善肺癌方面有一定作用。在昼夜节律紊乱合并肺癌模型中,酸枣仁皂苷呈剂量依赖性地显著提高小鼠自主活动、肺通气量,降低肺部荧光强度,减少肺部炎性浸润以及肿瘤结节数,促进肺部损伤修复,改善肺部病理结构进而起到改善肺癌的作用。在探讨昼夜节律紊乱促进肺癌发展的原因中,我们发现昼夜节律紊乱小鼠体重和自主活动次数均下降;小鼠碳粒廓清吞噬指数显著升高,溶血素和溶血空斑形成均显著升高;脾脏肿大;外周血炎性细胞,血清和肺泡灌洗液中炎性因子增多;异种移植瘤增长速度快,体积大,这些现象表明昼夜节律紊乱会导致小鼠体液免疫功能亢进,整体免疫下降;随后我们对昼夜节律紊乱的小鼠进行酸枣仁皂苷不同剂量给药,与未给药组相比,给药后的小鼠自主活动次数,碳粒廓清吞噬指数、溶血素以及溶血空斑形成均下降,并且昼夜节律紊乱小鼠外周血炎症细胞数量以及血清和肺泡灌洗液中IL-6,IL-1β,TNF-α炎性因子表达量减少。说明酸枣仁皂苷能够抑制体液功能亢进,减少炎性细胞和炎性因子的产生,逆转免疫低下,提升小鼠整体免疫应答能力。在探讨酸枣仁皂苷调节昼夜节律紊乱的机制中,我们首先通过网络数据库筛选并得到酸枣仁皂苷与昼夜节律紊乱的交集靶点,根据交集靶点得到与酸枣仁皂苷发生相互作用的相关靶点以及酸枣仁皂苷调节昼夜节律紊乱生物功能分析以及相关通路。根据Swiss Dock在线网站预测出酸枣仁皂苷与IL-6,STAT3有较高分子对接分数,然后将酸枣仁皂苷与IL-6,STAT3进行分子对接,并使用Pymol软件对作用位点进行可视化分析。我们发现网络药理学预测酸枣仁皂苷调节昼夜节律紊乱是通过细胞增殖的正向调节以及炎症反应等生物功能,以及癌症通路中的IL-6/STAT3生物信号轴;分子对接技术表明酸枣仁皂苷与IL-6、STAT3有氢键连接,有较好的结合。然后我们通过生物实验进行验证预测结果。我们发现在脾淋巴细胞增殖实验以及脾淋巴细胞ROS检测实验中,昼夜节律紊乱可以抑制小鼠T淋巴细胞增殖,促进B淋巴细胞增殖,促进脾淋巴细胞ROS增多,酸枣仁皂苷干预后,可促进小鼠脾T淋巴细胞增殖,抑制B淋巴细胞增殖,减少脾淋巴细胞ROS。蛋白免疫印迹法实验表明昼夜节律紊乱可以促进IL-6/STAT3的蛋白表达,酸枣仁皂苷干预后,抑制IL-6/STAT3的表达。以上实验结果表明酸枣仁皂苷通过作用于IL-6/STAT3生物信号轴,促进细胞增殖,调节炎症反应来调节昼夜节律紊乱,这与网络药理学预测结果一致。综上所述,昼夜节律紊乱促进肺癌的发展。酸枣仁皂苷通过调节昼夜节律紊乱减轻小鼠炎症反应,减缓体液免疫功能亢进,促进T淋巴细胞增殖,提高小鼠整体免疫能力,减轻肺部损伤,减少肺肿瘤结节数,调节肺部病理结构进而达到改善肺癌的目的。其调节昼夜节律紊乱的作用机制可能与酸枣仁皂苷阻断昼夜节律紊乱调控IL-6/STAT3生物信号轴有关。