目的:金蓉颗粒是治疗乳腺增生、辅助治疗乳腺癌的中药创新药,全方由淫羊藿、郁金、肉苁蓉等十味中药组成,功效“补肾活血、化痰散结、调摄冲任”,临床疗效良好。药理学研究显示金蓉颗粒通过调节机体雌激素水平和炎症因子释放,抑制肿瘤细胞的生长、增殖,但其治疗乳腺癌的药效物质基础和作用机制尚不明确。因此,本研究针对以上问题,对金蓉颗粒及其入血成分进行分析;以抗乳腺癌活性为导向,在入血成分分析基础上,应用网络药理学结合分子对接研究金蓉颗粒抗乳腺癌的潜在药效成分和作用机制;再经体外细胞实验验证预测药效成分的活性,对潜在作用机制进行初步探索。通过以上研究,旨在阐明金蓉颗粒抗乳腺癌的物质基础和作用机制,为扩大金蓉颗粒临床使用和用药安全提供理论依据。方法:1、金蓉颗粒体及其入血成分鉴定:建立金蓉颗粒化学成分数据库;通过UPLC-Q-TOFMS/MS检测金蓉颗粒样品溶液,并以各味药材的质量控制指标性成分和关键成分为依据选择了14个成分进行对照品比对。选择SD大鼠,通过分别给药金蓉颗粒和生理盐水,制备金蓉颗粒含药血清和空白血清;构建金蓉颗粒及其入血成分的超高效液相-四极杆-时间飞行质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)分析方法:使用色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0×100mm,1.8μm),以乙腈-0.05mmol/L甲酸铵水溶液进行梯度洗脱,结合ESI离子化方式,采集金蓉颗粒及其含药血清中化学成分在正、负离子模式下的质谱信息。运用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站分析处理功能,对金蓉颗粒及其入血成分进行定性、定量分析。2、基于网络药理学和分子对接探究金蓉颗粒抗乳腺癌的作用机制:以入血成分浓度和化学成分活性为依据,选择水苏碱、木兰花碱、松果菊苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、大黄素、红景天苷、β-榄香烯、莪术二酮进行网络药理学分析。使用Pub Chem和Swiss Target Prediction数据库预测金蓉颗粒潜在活性成分的作用靶标;检索Malacards、Gene Cards、Dis Ge NET、CTD和OMIM获得乳腺癌的相关靶点。通过Venny V2.8软件和Cytoscape 3.9.0进行拓扑分析数据处理,筛选金蓉颗粒治疗乳腺癌的潜在作用靶点。应用g:Profiler、Omicshare数据库对潜在靶点进行GO和KEGG富集分析。构建“中药-主要活性成分-潜在靶点-通路”网络图,分析获得关键靶点、药效成分和潜在作用通路。使用确认细节Auto Dock Tools1.5.7软件和Auto Dock Vina程序进行潜在成分-靶点的分子对接,以结合能大小和形成氢键为指标,判断靶点和关键成分的自发结合能力。使用Py MOL软件使复合物可视化。3、金蓉颗粒药物血清抗乳腺癌的药效成分验证及相关作用机制研究:对金蓉颗粒含药血清和分子对接预测的可能药效成分-淫羊藿苷,宝藿苷I,木兰花碱,松果菊苷,丹参酮IIA,大黄素,莪术二酮,红景天苷进行药效学验证,以人乳腺癌细胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象,采用CCK8法考察金蓉颗粒含药血清及以上成分对两株乳腺癌细胞增殖活性的影响,并计算各成分的半数抑制率(IC50)值,以此作为后续机制研究的干预浓度。分别设立空白组、金蓉颗粒含药血清低、中、高浓度组、淫羊藿苷组、宝藿苷I组、木兰花碱组、松果菊苷组、丹参酮IIA组、大黄素组、莪术二酮组、红景天苷组,免疫印迹测定药物干预后表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝源活化蛋白激酶1(MEK1)、Ras蛋白(RAS)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)蛋白的表达情况。验证金蓉颗粒含药血清及其潜在活性成分是否通过调控EGFR-PI3K和RAS-MAPK信号通路抗乳腺癌。结果:1、建立金蓉颗粒Spectrophotometry成分数据库,共获得1367个化学成分。从金蓉颗粒样品溶液中共鉴定出99个化合物,主要包括淫羊藿中黄酮类,共36个;肉苁蓉中环烯醚萜苷、木脂素类、苯乙醇苷类等,共12个;丹参中二萜类、酚酸类,共23个;女贞子中环烯醚萜类、酚酸类、黄酮类,共17个。在此基础上对金蓉颗粒含药血清进行分析,鉴定得出56个原型成分。金蓉颗粒吸收入血的原型成分主要为黄酮类、二萜类和酚酸类,以黄酮类成分血药浓度较高。2、从Malacards、Gene Cards等数据库中检索获得乳腺癌相关的基因靶点22794个,使用Pub Chem和Swiss Target Prediction数据库预测金蓉颗粒潜在活性成分的作用靶点共获得309个相关靶点,两者交集靶点308个,经分析筛选,确定其中21个蛋白为关键靶点蛋白。GO功能富集分析得条目35个,金蓉颗www.selleck.cn/products/Fulvestrant粒治疗乳腺癌与对多条通路的调控,及对细胞增殖、存活、迁移和代谢、血小板活化及白细胞游走的调节等相关。KEGG通路分析共获44条通路,其中VEGF通路、Erb B通路、Estrogen通路、m TOR通路和PI3K/Akt通路等23条与乳腺癌密切相关的通路。结合蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network,PPI)筛选和KEGG筛选共获得6个与乳腺癌发生发展密切相关的靶点蛋白:EGFR、RAS、MEK1、PI3K、m TOR,将其分别与水苏碱、木兰花碱、松果菊苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、大黄素、红景天苷、莪术二酮等潜成分进行分子对接,均能自发性结合。提示这些成分可能存在抗乳腺癌的活性,是金蓉颗粒治疗乳腺癌的潜在药效成分,且其作用机制与调控PI3K/Akt信号通路和RAS/MAPK信号通路密切相关。3、金蓉颗粒的细胞增殖抑制实验:(1)MDA-MB-231细胞:经不同百分含量金蓉颗粒含药血清干预后,细胞增殖速度减慢,当含药血清百分含量达10%时,对细胞的抑制率超过50%;淫羊藿苷,宝藿苷I,木兰花碱,松果菊苷,丹参酮IIA,大黄素,莪术二酮,红景天苷干预细胞,测得各成分IC50分别为6.627、17.510、4.710、157.900、6.564、14.230、6.163和93.784μM。(2)4T1细胞:金蓉颗粒含药血清干预细胞,血清百分含量为2%时对细胞有抑制作用,当含量达10%时对细胞的抑制率超过50%;淫羊藿苷,宝藿苷I,木兰花碱,松果菊苷,丹参酮IIA,大黄素,莪术二酮,红景天苷干预细胞,测得各成分IC50分别为2.136、3.263、12.900、4.132、2.209、15.250、0.113和79.785μM。金蓉颗粒抗乳腺癌的作用机制研究:金蓉颗粒含药血清处理MDA-MB-231细胞和4T1细胞后,RAS,MEK1,PI3K,EGFR和m TOR蛋白表达显著下调。淫羊藿苷,宝藿苷I,木兰花碱,松果菊苷,丹参酮IIA,大黄素,莪术二酮,红景天苷分别对MDA-MB-231细胞和4T1细胞进行干预,木兰花碱、松果菊苷、丹参酮IIA对PI3K、EGFR和m TOR蛋白有显著下调作用,淫羊藿苷干预后MEK1,PI3K,EGFR,m TOR表达下调,但对RAS无明显作用,宝藿苷I、丹参酮IIA,大黄素,莪术二酮,红景天苷对RAS、MEK1,PI3K,EGFR,m TOR均有下调作用,与空白组比有显著差异。结论:本研究建立了金蓉颗粒及其入血成分的UPLC-Q-TOF-MS检测方法,初步阐明金蓉颗粒的化学成分物质基础;预测了金蓉颗粒抗乳腺癌的潜在药效成分和信号通路;并经体外细胞实验发现,金蓉颗粒抑制乳腺癌活性可能与抑制RAS,MEK1,PI3K,EGFR,m TOR蛋白表达有关,且其可能参与调控PI3K/Akt/m TOR通路和RAS/MAPK通路。其中淫羊藿苷,宝藿苷I,木兰花碱,松果菊苷,丹参酮IIA,大黄素,莪术二酮,红景天苷等成分可能为其发挥作用的主要成分。研究结果为金蓉颗粒临床精准治疗和体现功效内涵式质量标准制定奠定科学依据。