迄今为止,冠心病(Coronary heart disease,CHD)对于全球人类健康的威胁地位一直以来都是我们未曾撼动的,其发病率、致残率、致死率依然在逐年攀升并且呈现逐步年轻化趋势。2019年全球超过1860万人死于心血管疾病。根据我国国家心血管中心近期发布的报告显示:目前我国心血管疾病患者超3.3亿,其中冠心病患者占据主体,防控形势严峻。目前,大约99%的冠状动脉性心脏病均由冠状动脉粥样硬化引起,故冠状动脉粥样硬化仍然是冠心病的主要病因,但其发病机制尚不完全明确,可能是多种因素综合作用所致。因此,在一定程度上我们可以认为冠心病Gefitinib就是冠状动脉粥样硬化发生、发展的结果。众所周知,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性增生性、渐进发展性、炎性疾病,其特征通常是由于脂类成分、纤维性成分、炎性细胞和炎性分子在动脉壁上发生累积,并伴随着内皮损伤或者内皮功能的障碍而开始。其发生机制主要涉及脂质浸润学说、氧化应激学说、损伤反应学说、炎症学说、血小板聚集和血栓形成学说、平滑肌细胞克隆学说等等。事实上,炎症反应是动脉粥样硬化的始动环节、触发因素而又贯穿始终。自最早“铁源性心脏病”假说于1981年首次提出,到后来人们对“铁超负荷血管病”的认识,再到目前2023年全球有关“代谢性高铁蛋白血症”共识的发出,都使得“铁和铁蛋白”在心血管疾病研究领域中地位突显,且以此为研究基础的“铁缺乏”(asiderosis)、“铁超载”(Iron overload)、“铁死亡”(Ferroptosis)都不断刷新着人们对于心血管疾病的认识。铁是生命所必需的元素,然而过量的铁会通过Fenton反应导致氧化应激。铁缺乏在心力衰竭患者中普遍存在,而铁过载与动脉粥样硬化的发病机制有关。这些发现表明了心血管疾病中的“铁悖论”。此外,我们知道铁在人类动脉粥样硬化病变中累积,但它是动脉粥样硬化形成的原因还是仅仅是动脉粥样硬化形成的下游结果,几十年来一直是一个悬而未决的问题。铁具有催化活性,可参与活性氧、羟自由基的生成,诱导脂质过氧化,引发内皮细胞功能紊乱、平滑肌细胞增殖与巨噬细胞活化等,而所有这些过程都被认为铁是致动脉粥样硬化源。近40年来,人们对铁过载、氧化应激、内皮功能障碍、动脉粥样硬化的相关临床研究亦加强了”铁假说”,即铁对心血管系统有害,从而促进动脉粥样硬化的发生、发展。但另一方面,也有学者观察到在血色素沉着症患者,终身受铁过量的影响,却没有显示出动脉粥样硬化发病率增加,这一结果又成为了反对“铁假说”最令人信服的证据。无论流行病学研究还是来自动物模型的数据,都显示了关于“铁在动脉粥样硬化形成中的作用”相互矛盾的证据。因此,需要进行更加优化、细化甚至也可能是一定重复性的研究工作,来逐步认识、反复验证才能有望解决分歧与争议并可能探究事物的本质。本课题一部分基于临床研究,通过对比观察冠脉阴性对照组、临床诊断冠状动脉粥样硬化组、临床诊断冠心病组上述三组患者血清铁蛋白SF的水平变化与组间差异,同时平行观察临床常见炎症因子(IL-1β、CRP)、常见相关生化指标(HDL-C、LDL-C、ox LDL、TBIL、SF/TBIL比值、Hcy)、反应冠脉狭窄程度及冠脉粥样硬化程度指标(Gensini评分、斑块负荷)等的相应水平变化并比较其相关性,来探究SF在冠状动脉粥样硬化发生、发展中的作用及可能机制。另一部分基于动物实验,主旨在于通过逆向干预铁蛋白表达来观察其对动脉粥样硬化的影响,以高脂膳食喂养Apo E基因敲除小鼠来建立动脉粥样硬化模型,通过对铁蛋白(FTH1)基因进行沉默与过表达处理,来对比观察冠状动脉粥样硬化小鼠最小管腔直径、管腔面积及斑块大小的变化,监测其体内IL-1β、IL-10、TNF-α的水平变化和MMP8、MMP12、MMP13的水平差异,以及其对p-JNK/pc-Jun信号通路的影响,旨在揭示干预铁蛋白表达水平对动脉粥样硬化进程的影响。总之,本研究分别从人体与动物的角度,通过正向观察与逆向干预铁蛋白水平,旨在进一步揭示铁蛋白与动脉粥样硬化的关系及其可能机制,进而为动脉粥样硬化的防治提供新的靶点与思路。第一部分铁蛋白在冠状动脉粥样硬化中的作用与机制分析目的:本研究旨在通过临床诊断冠状动脉粥样硬化程度的分层分组观察和对比分析,进一步研究和考证铁蛋白与冠状动脉粥样硬化的关系以及铁蛋白在其中的作用,并揭示其可能机制。方法:选取我院2019年1月至2021年12月因胸闷、胸痛等相关症状来院就诊并符合入选条件的初诊患者共115例入组(男81例,女34例,平均年龄60.37±7.80岁)。经冠脉造影检查和血管内超声证实结果完全阴性者入正常对照组(即NC组30例),冠脉造影检查并经血管内超声证实血管狭窄程度<50%入冠脉粥样硬化组(即CAS组40例),经冠脉造影检查且经血管内超声证实血管狭窄程度≥50%入冠心病组(即CHD组45例)。冠心病的诊断标准符合《中国稳定性冠心病诊断与治疗指南》要求。即:冠脉造影证实心外膜下左主干、三大分支至少有一支或其主要分支直径狭窄范围≥50%。同理冠脉粥样硬化的诊断。三组患者均符合本研究的入选条件与排除标准,经医院伦理委员会批准并签署知情同意书。所有入选患者由专人收集年龄、性别、体重指数、吸烟史、饮酒史、合并症病史等一般资料。所有入选患者均于次日清晨卧位空腹8小时以上抽血,分别化验血清铁蛋白(SF)、白介素1β(IL-1β)、C反应蛋白(CRP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、氧化型低密度脂蛋白(ox LDL)、总胆红素(TBIL)、同型半胱氨酸(Hcy)并计算SF/TBIL比值,将三组患者SF及其余各指标的水平变化与组间差异进行单因素方差分析,并对比SF与炎症因子(IL-1β、CRP)、生化指标(HDL-C、LDWhole Genome SequencingL-C、ox LDL、TBIL、SF/TBIL比值、Hcy)、反应冠脉狭窄程度和冠脉粥样硬化程度指标(Gensini评分、斑块负荷)之间的相关性和彼此间交互相关性,同时分析各指标与是否诊断冠状动脉粥样硬化(是否CAS)、是否诊断冠心病(是否CHD)的相关性,利用二元Logistic回归分析明确冠状动脉粥样硬化和冠心病的独立危险因素。结果:1三组临床资料的基本特征比较本研究所纳入的三组患者在年龄、体重指数(BMI)、左室射血分数(LVEF)等基本资料方面具有可比性。三组在性别、合并高血压、糖尿病、合并吸烟、饮酒的人员构成比方面分布均匀,差异无明显统计学意义;且三组患者于入组时的糖化血红蛋白(Hb A1c)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)等基本情况控制良好,具有临床可比性。患者在入院时的白细胞(WBC)、血红蛋白(Hgb)等指标差异无统计学意义,且均在正常范围。2三组患者血脂水平的比较与NC组比较,CAS组LDL-C有明显升高(P<0.05),而TG、TC、HDL-C的变化无明显统计学意义(P>0.05)CHD组TG、LDL-C均有明显升高,HDL-L有明显降低(P<0.01);与CAS组比较,CHD组LDL-C亦有明显升高而HDL-C有明显降低(P均<0.05)。3三组间SF、炎症因子、Gensini评分及斑块负荷的比较与NC组相比,SF、IL-1β、Gensini评分、斑块负荷在CAS组有所升高,SF、IL-1β、CRP、Gensini评分、斑块负荷在CHD组进一步升高,且其差异水平均具有明显统计学意义(P<0.01),唯有CRP在CAS组的升高程度不具有统计学差异(8.76±3.57 vs 10.77±3.47,P=0.06)。与CAS组相比,SF、IL-1β、CRP、Gensini评分、斑块负荷在CHD组的进一步升高,均具有统计学意义(P<0.01)。4 SF、炎症因子IL-1β、CRP、Gensini评分及斑块负荷的相关性分析于CAS组:SF与炎症因子IL-1β、CRP均呈正相关(r=0.796,P<0.01&r=0.689,P<0.01),SF、IL-1β、CRP与Gensini评分、斑块负荷亦均呈正相关(P<0.01),但其中CRP与Gensini评分相关性不明显(r=0.192,P>0.05)需除外。于CHD组:SF与炎症因子IL-1β呈强正相关(r=0.889,P<0.01),SF与CRP呈正相关(r=0.342,P<0.05),SF、IL-1β与Gensini评分、斑块负荷亦呈正相关(P<0.05),但CRP与Gensini评分、斑块负荷无相关性(r=0.189,P=0.215&r=0.251,P=0.096)。无论CAS组还是CHD组,SF、IL-1β与斑块负荷的相关性似乎都要比其与Gensini评分的相关性更为显著;同时我们可以看到无论CAS组还是CHD组,Gensini评分与斑块负荷均无明显相关性(r=0.264,P>0.05&r=0.215,P>0.05)。5三组生化指标SF、ox LDL、TBIL、SF/TBIL、Hcy的比较与NC组比较,SF、ox LDL、SF/TBIL、Hcy各指标水平在CAS组有所升高,TBIL有所降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);SF、ox LDL、SF/TBIL、Hcy在CHD组进一步升高,TBIL在CHD组进一步降低,且差异具有明显统计学意义(P<0.01)。与CAS组比较,SF、ox LDL、SF/TBIL在CHD组进一步升高,TBIL在CHD组进一步降低,差异均具有明显统计学意义(P<0.05);而Hcy在CHD组的升高尚不具有统计学意义。6血清SF水平、ox LDL与HDL-C、TBIL、SF/TBIL、Hcy、Gensini评分、斑块负荷的相关性分析于CAS组,SF与ox LDL、SF/TBIL呈明显正相关(r=0.713,P<0.01&r=0.811,P<0.01),SF与LDL-C、Hcy呈正相关(r=0.526,P<0.01&r=0.679,P<0.01),SF与HDL-C、TIBL呈负相关(r=-0.667,P<0.01&r=-0.594,P<0.01)。ox LDL与LDL-C、SF/TBIL、Hcy呈正相关(r=0.543,P<0.01&r=0.653,P<0.01&r=0.562,P<0.01),ox LDL与HDL-C、TIBL呈负相关(r=-0.534,P<0.01&r=-0.464,P<0.01)。SF、ox LDL、LDL-C、Hcy、SF/TBIL与Gensini评分、斑块负荷均呈正相关(P<0.05),且其与斑块负荷的相关性比Gensini评分普遍更为显著。但HDL-C、TBIL与Gensini评分、斑块负荷均呈负相关(P<0.05),当然TBIL与Gensini评分的相关性不明显(r=-0.292,P=0.068)需除外。于CHD组,SF与SF/TBIL呈强正相关(r=0.861,P<0.01),SF与ox LDL、LDL-C、Hcy呈正相关(r=0.690,P<0.01&r=0.360,P<0.05&r=0.594,P<0.01),SF与HDL-C、TIBL呈负相关(r=-0.479,P<0.01&r=-0.674,P<0.01)。ox LDL与LDL-C、SF/TBIL、Hcy呈正相关(r=0.418,P<0.01&r=0.629,P<0.01&r=0.350,P<0.05),ox LDL与HDL-C无关(r=-0.231,P>0.05),ox LDL与TIBL呈负相关(r=-0.510,P<0.01)。SF、ox LDL、LDL-C、Hcy、SF/TBIL与Gensini评分、斑块负荷均呈正相关(P<0.05),且上述指标与斑块负荷的正相关性似乎普遍比其与Gensini评分的正相关性更为显著Ferroptosis抑制剂。但其中LDL-C与斑块负荷(r=-0.176,P>0.05)、Hcy与Gensini评分(r=0.224,P>0.05)的相关性不明显需排除在外。同时发现HDL-C、TBIL与Gensini评分、斑块负荷均呈负相关(P<0.05)。7各指标与是否CAS、是否CHD相关性分析通过Spearman相关性分析显示:SF、IL-1β、CRP、ox LDL、SF/TBIL、Hcy、Gensini评分、斑块负荷与冠状动脉粥样硬化呈正相关,TBIL与冠状动脉粥样硬化呈负相关,TG、TC、LDL-C、HDL-C与冠状动脉粥样硬化相关性不明显;SF、IL-1β、CRP、LDL-C、ox LDL、SF/TBIL、Gensini评分、斑块负荷与冠心病呈正相关,TBIL与冠心病呈负相关,TG、TC、HDL-C、Hcy与冠心病相关性不明显。8二元Logistic回归分析冠状动脉粥样硬化和冠心病的影响因素8.1二元Logistic回归分析冠状动脉粥样硬化的影响因素,将年龄、性别、SF、IL-1β、CRP、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox LDL、HCY、TBIL、SF/TBIL等作为入选指标,最终SF、IL-1β、ox LDL进入方程,结果表明:在矫正了性别、年龄等混杂因素的影响后,SF、IL-1β、ox LDL是冠状动脉粥样硬化的独立危险因素(P<0.05)。8.2二元Logistic回归分析冠心病的影响因素,同样将年龄、性别、SF、IL-1β、CRP、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox LDL、HCY、TBIL、SF/TBIL等作为入选指标,最终未发现可以进入方程产生影响力的变量,考虑可能与CHD组的样本量偏小而纳入回归方程的指标变量过多有关,或是受到隐匿的残余混杂因素的影响。结论:1.铁蛋白与冠状动脉粥样硬化和冠心病的发生有关,其水平会随着动脉粥样硬化的程度加剧而升高。2.铁蛋白可作为促炎因子协同IL-1β激化炎症反应,作为致氧化因子协同ox LDL促进氧化应激,一定程度上协同Hcy紊乱内皮功能,来参与冠状动脉粥样硬化的发生、发展。3.SF、IL-1β、ox LDL是冠状动脉粥样硬化的独立危险因素。4.SF/TBIL比值对冠状动脉粥样硬化和冠心病的预测价值有限。5.作为评价动脉粥样硬化斑块及管腔自身狭窄程度的指标斑块负荷更优;而作为评定冠心病病情轻重的指标似乎Gensini评分更佳。第二部分沉默铁蛋白对Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化的影响目的:高脂膳食喂养Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠来建立动脉粥样硬化模型,通过对铁蛋白(ferritin heavy chain 1,FTH1)基因进行沉默与过表达处理,来对比观察反向干预铁蛋白水平如何影响动脉粥样硬化进程及相关炎症反应过程。方法:给与Apo E-/-小鼠喂养高脂膳食来建立的小鼠动脉粥样硬化模型,通过检测其总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平及主动脉内中膜厚度来明确模型建立是否成功;再根据对铁蛋白表达干预方式的不同将模型小鼠分为对照组(空载体)、铁蛋白过表达组与铁蛋白沉默组,通过对铁蛋白(ferritin heavy chain 1,FTH1)基因进行沉默与过表达处理,来对比观察动脉粥样硬化小鼠主动脉的最小管腔直径、管腔面积及斑块大小的变化;并通过ELISA和Western blot的方法来评价观察其对白细胞介素(ILs)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、基质金属蛋白酶系列(MMPs)以及p-JNK/pc-Jun信号通路的影响,来说明干预铁蛋白表达可以在一定程度上调控动脉粥样硬化的进展,影响相关炎症反应过程,并阐释其可能机制。结果:1.高脂饮食在Apo E-/-小鼠中产生促动脉粥样硬化的脂质谱和致动脉粥样硬化病变与正常饮食(ND)相比,高脂饮食喂养24周后导致Apo E-/-小鼠促动脉粥样硬化脂质水平显著升高。TG、TC和LDL-C分别从0.88、10.06和8.06mmol/L上升到4.89、25.06和15.76 mmol/L(P<0.05),而HDL-C从2.06 mmol/L上升至2.09 mmol/L几乎没有变化(P>0.05)。高脂饮食喂养的小鼠动脉粥样硬化斑块的大小明显大于正常饮食喂养的小鼠。此外,血管管腔亦呈现出明显狭窄(P<0.05)。同时监测各组小鼠喂养过程中主动脉内中膜厚度(IMT)的变化发现:与对照组相比,模型组小鼠主动脉内中膜厚度于12周开始出现明显增厚(P<0.05),并说明模型建立成功。2.沉默铁蛋白减少动脉粥样硬化病变PCR检测显示:注射沉默和过表达载体后5天,血清铁蛋白m RNA水平分别显著下调和上调,表明载体分别能有效降低和增加铁蛋白表达(P<0.01)。干预后20天,与空载体组小鼠相比,铁蛋白过表达载体组小鼠动脉粥样硬化斑块面积显著增加,而沉默载体组小鼠动脉粥样硬化斑块面积显著减少(P<0.01)。在铁蛋白过表达载体处理的小鼠中,最小管腔直径和管腔面积显著减小,而在铁蛋白沉默载体处理的小鼠中,最小管腔直径和管腔面积显著增加(P<0.05)。3.沉默铁蛋白改变IL-1β、IL-10和TNF-α水平注射沉默和过表达载体后20天,我们检测小鼠的IL-1β、IL-10和TNF-α水平。结果显示:与空载体处理的小鼠相比,铁蛋白过表达或沉默载体处理的小鼠的IL-1β和IL-10水平分别显著升高或降低(P<0.01)。另一方面,铁蛋白过表达载体处理的小鼠TNF-α水平显著降低(P<0.05),而铁蛋白沉默载体处理的小鼠TNF-α水平显著增加(P<0.01)。4.沉默铁蛋白改变MMP8、MMP12和MMP13的表达本研究还测定了MMP8、MMP12和MMP13的水平,结果显示:铁蛋白过表达载体处理后,MMP8、MMP12和MMP13水平显著升高,铁蛋白沉默载体处理后,MMP8、MMP12和MMP13水平显著降低(P<0.01)。5.沉默铁蛋白激活了p-JNK/pc-Jun信号通路我们评估了p-JNK/pc-Jun信号通路中的蛋白表达。Western blot结果显示:与对照组相比,铁蛋白过表达导致了p-JNK表达的增加,而铁蛋白沉默则降低了该蛋白的表达(P<0.05)。另一方面,pc-Jun水平保持不变(P>0.05)。结论:1.沉默铁蛋白可以减轻Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化的程度,反之过表达铁蛋白则会加剧;2.铁蛋白可通过影响炎症因子水平、MMPs水平进而影响动脉粥样硬化程度;3.铁蛋白可通过p-JNK/c-Jun信号通路调控动脉粥样硬化的进展;4.铁蛋白可以作为动脉粥样硬化防控的新靶点而存在。