禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus,ARV)可引起禽类多种疾病。近年来,我国鸡群感染ARV有增加趋势,而且临床症状也表现多样,给我国养殖业造成巨大经济损失。一些免疫过ARV疫苗的鸡群也出现较高发病率,给ARV的防控增加了难度。为了解近年来我国ARV流行状况及流行毒株分子遗传进化、致病性和疫苗保护性等情况,本研究采集2019年1月-2022年9月华东地区的疑似ARV样本,对ARV的流行病学、基因组遗传进化、致病性及疫苗保护等方面进行研究。具体内容如下:1.2019年1月-2022年9月我国华东地区流行病学调查采集2019年1月-2022年9月我国山东、福建、江苏、浙江和安徽华东5省份256个鸡场疑似ARV的组织样本2076份以及71个鸡场的2631份血清样本进行检测。RT-PCR检测结果显示69个鸡场的277份样本ARV核酸阳性(阳性率为13.34%),感染日龄主要集中在2-6周龄(占比84.8%),易感品种主要为白羽肉鸡,其次是肉种鸡。血清样本的ELISA抗体检测结果显示,59个鸡场的2160份样品为ARV抗体阳性(阳性率为82.10%)。按照年度统Rapamycin说明书计,2019年至2022年度,采集样本中ARV病原阳性率分别为5.4%、11.2%、20.1%和12.8%;抗体阳性率分别为84.73%、78.28%、87.5%和70.23%。277份ARV核酸阳性样本进一步利用LMH细胞进行病毒分离,共分离获得90株KPT-330ARV病毒。结合σC基因遗传进化特征及ARV病毒血清学分型规律,将ARV经典的1、2、3、4、5、6总共6个分支(基因型)进一步细分为1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、3、4.1、4.2、4.3、5和6共11个小分支(基因型)。根据新的划分标准,本研究分离的90株毒株分属于1.2、1.3、2.1、2.2、3、4.2、4.3和5共8个基因型,其中1.3、2.2、4.3和5分支毒株最多,为华东地区主要流行基因型。2.不同基因型ARV全基因组测序分析筛选华东主要流行的1.3、2.2、4.3和5分支代表毒株20191774、201910415、20206919和20209560进行全基因组测序。基因序列比对结果表明所测4株病毒的10个基因组片段均来自鸡源呼肠孤病毒,但与Gen Bank中ARV有一定差异,均发生了不同程度的片段重组或核苷酸位点突变,其中201910415毒株在L2基因发生基因片段内重组。3.ARV Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法建立通过对Gen Bank中ARV序列信息以及本研究测得不同基因型ARV序列信息进行比对分析,在M3基因的保守区设计引物和探针,制备标准品,建立检测所有基因型ARV的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明:该方法标准曲线线性关系良好,相关系数R~2达到0.999,扩增效率为108.196%;敏感性高,检测最低病毒模板浓度为1.0×10~1copies/μL,是普通RT-PCR的100倍;特异性强,与其他常见禽病不发生交叉反应;重复性好,组间组内重复变异系数小于1%;检测范围广,能检测S1133疫苗株和目前我国华东地区流行的所有基因型毒株。说明本研究建立的方法可广泛应用于我国各省份样品中ARV的定性和定量检测。4.动物感染模型的建立本研究测定20191774、201910415、20206919和20209560这4株流行代表株的ELD_(50)。选取ELD_(50)最低的20206919做为攻毒毒株,以脚垫接种、口服和口服同居三种方式对1日龄SPF鸡和5日龄白羽肉鸡进行攻毒试验,结果表明SPF鸡脚垫攻毒可以引起脚垫肿胀症状可作为攻毒模型,SPF鸡经口服和口服non-alcoholic steatohepatitis同居感染未发生明显临床症状,但是抗体转阳,肉鸡通过不同接种方式攻毒均出现典型的临床症状可作为致病性模型。5.不同基因型ARV对肉鸡致病性研究本研究对20191774、201910415、20206919和20209560进行肉鸡致病性研究。结果表明这4株毒株均能引起白羽肉鸡脚垫及关节肿胀等与临床相似症状,但并未发生死亡。4株ARV流行株可引起肉鸡病毒性关节炎、生长抑制等症状,其中20191774(1.3分支)毒株对体重的影响以及造成脚垫肌腱损伤最严重,排毒量和组织病毒载量也最高,表明其致病力最强,其次是201910415(2.2分支),而20209560(5分支)和20206919(4.3分支)致病力相对较轻。6.两种商品疫苗对不同基因型ARV的攻毒保护性研究为验证目前商品疫苗是否能保护当前流行ARV毒株的感染,本研究选取市场上常用的两种ARV疫苗对SPF鸡进行免疫,其中疫苗A为国产多价苗,疫苗B为进口疫苗。利用当前流行代表株20191774(1.3分支)、201910415(2.2分支)、20206919(4.3分支)和20209560(5分支)毒株进行攻毒。结果表明,疫苗A对1.3、4.3和5分支毒株的保护率为100%,而对2.2分支毒株的保护率仅为20%;免疫疫苗B对1.3、2.2、4.3和5分支毒株的攻毒保护率均为0%。7.实验室制备ARV候选疫苗对不同基因型毒株保护性试验研究本研究从90株流行株中筛选出毒力较强的,2019-2022年流行较多的1.3、2.2和5分支代表株20191774、201910415和20209560作为疫苗候选株。这三株毒株经LMH细胞增殖,按照1:1:1比例制备油乳剂灭活疫苗。制备好的灭活疫苗免疫SPF鸡,利用1.3、2.2、4.3、5分支代表株20191774、201910415、20206919和20209560毒株进行攻毒。结果表明,免疫灭活多价苗的SPF鸡均未发病,免疫保护率为100%,制备的候选苗对不同基因型毒株的保护效果较好。