研究背景与目的:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)已成为临床危重病学研究的热点和难点。其发病机制复杂,目前尚缺乏有效的药物治疗。核因子-红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)是一种重要的抗氧化因子,在改善包括急性肺损伤在内的各种炎症和氧化应激相关疾病中发挥着重要作用。黄柏酮(Obacunone,OB)是一种广泛存在于柑橘类水果中的天然黄酮类化合物,具有抗炎和抗氧化等活性。然而,黄柏酮在ALI中的治疗作用及其潜在机制尚不清楚。铁死亡是一种脂质过氧化、铁离子依赖的级联程序性细胞死亡方式。区别于凋亡、自噬和焦亡等程序性细胞死亡形式,铁死亡的主要特征是脂质过氧化和氧化物积累,细胞内线粒VP-16生产商体萎缩,线粒体嵴减少或消失。已有研究表明,包括ALI在内的多种疾病的发生发展与铁死亡密切相关,而Nrf2介导的抗氧化应激具有明显的抑制铁死亡作用,因此通过激活Nrf2靶向抑制铁死亡有望成为ALI新的治疗手段。本研究通过构建脂多糖诱导BEAS-2B细胞损伤及小鼠肺急性损伤模型,重点探讨黄柏酮是否可通过Nrf2途径抑制铁死亡进而缓解急性肺损伤。材料与方法:1.黄柏酮对急性肺损伤细胞及动物模型的保护作用在人肺上皮细胞BEAS-2Medical ScribeB上用脂多糖处理,构建急性肺损伤细胞模型。CCK-8检测细胞活力和LDH释放实验评价Obacunone治疗后细胞存活情况;ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子释放情况;EDU实验、7-AAD流式细胞染色计数评价细胞损伤情况。运用脂多糖处理构建急性肺损伤动物模型。肺组织外观充血情况、HE染色、TUNEL染色实验等检测评价小鼠肺损伤情况;ELISA检测小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子释放情况。分别在人肺上皮细胞BEAS-2B及小鼠急性肺损伤模型上,Dihydroethidium(DHE)荧光染色评价黄柏酮处理前后ROS释放情况,并在组织水平检测氧化应激相关指标MDA、CAT、GSH和SOD的活性。2.铁死亡在黄柏酮减轻急性肺损伤中的作用研究脂多糖处理人肺上皮细胞BEAS-2B构建急性肺损伤细胞模型。在细胞水平上,免疫荧光检测GPX4、4-HNE的表达;免疫印迹检测GPX4和SLC7A11的表达;Fe~(2+)检测试剂盒检测Fe~(2+)的表达情况;透射电镜检测铁死亡的发生情况。在LPS处理构建急性肺损伤动物模型上,免疫组化检测GPX4、4-HNE的表达,免疫印迹检测GPX4和SLC7A11的表达。3.黄柏酮抑制铁死亡的机制研究在急性肺损伤细胞及动物模型上,通过免疫荧光和免疫组化检测黄柏酮对Nrf2表达的影响;同时,使用免疫印迹法检测细胞及肺组织中Nrf2的表达情况。Nrf2抑制剂(ML385)联合黄柏酮处理,小鼠肺组织DHE荧光染色、HE染色、GPX4和4-HNE免疫组化染色;ELISA检测IL-1β,IL-6,TNF-α的表达水平、Fe~(2+)检测试剂盒检测Fe~(2+)更多的表达情况、透射电镜检测铁死亡的发生情况,明确黄柏酮减轻急性肺损伤是否通过Nrf2。在急性肺损伤细胞模型上,WB检测Nrf2相关机制通路中Nrf2、Keap1的表达;q PCR检测Nrf2相关机制通路中Nrf2的m RNA水平。Nrf2合成抑制剂(cycloheximide)和蛋白酶体抑制剂(MG132)分别联合黄柏酮处理,结合CO-IP等技术方法评价黄柏酮对Nrf2的调控作用。结果:1.黄柏酮对急性肺损伤细胞及动物模型的保护作用细胞水平:与对照组相比,脂多糖诱导BEAS-2B细胞活力在一定时间和剂量范围内显著降低,并且在一定时间和剂量范围内LDH释放增加。黄柏酮处理后,显著逆转了脂多糖诱导的BEAS-2B细胞活力下降。为了进一步分析黄柏酮的保护效果,我们在脂多糖诱导前使用不同浓度的黄柏酮预处理BEAS-2B细胞,结果显示,BEAS-2B细胞活力随着黄柏酮浓度增加而增加,LDH释放以剂量依赖性方式减少。此外,黄柏酮处理后脂多糖诱导BEAS-2B细胞分泌的炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α在一定剂量范围内减少,EDU染色和流式细胞术结果表明黄柏酮对脂多糖诱导BEAS-2B损伤具有保护作用。动物水平:基于课题组前期研究,成功构建小鼠脂多糖诱导急性肺损伤模型。与对照组相比,脂多糖诱导后小鼠肺大体明显水肿充血,小鼠肺泡灌洗液中IL-6、1L-1β、TNF-α的分泌增加,以及上调肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞数和蛋白含量。黄柏酮处理显著改善了小鼠肺组织细胞凋亡和损伤、间质充血水肿增厚、组织结构丢失炎性反应。分别在人肺上皮细胞BEAS-2B及小鼠急性肺损伤模型上,与对照组相比,脂多糖诱导后Dihydroethidium(DHE)荧光染色增强,细胞和组织水平ROS释放增加,在肺组织水平检测MDA活性增加,然而肺组织中CAT、GSH和SOD的活性明显降低。值得注意的是,黄柏酮处理后能够逆转脂多糖对人肺上皮细胞BEAS-2B及小鼠急性肺损伤模型的损伤情况。2.铁死亡在黄柏酮减轻急性肺损伤中的作用研究在脂多糖诱导的急性肺损伤模型中,通过铁离子检测试剂盒检测Fe~(2+)及免疫印迹检测GPX4、4-HNE和SLC7A11水平来评估BEAS-2B细胞和肺组织中的铁死亡情况。与对照组相比,脂多糖组BEAS-2B细胞中GPX4蛋白水平及其GPX4m RNA水平显著降低,4-HNE和Fe~(2+)水平显著升高。此外,在黄柏酮处理后,BEAS-2B细胞和小鼠肺组织中GPX4和SLC7A11水平均升高;同样,脂多糖组小鼠GPX4水平显著降低,4-HNE水平显著升高。免疫组化染色和透射电镜(TEM)分析显示,TEM可观察到明显的线粒体收缩,线粒体嵴减少或消失。接下来,我们用铁死亡抑制剂(Fer-1:5 mg/kg)预处理小鼠后,我们发现,在脂多糖诱导的急性肺损伤的小鼠模型中,黄柏酮显著抑制了铁死亡指标和炎症反应,这与Fer-1治疗的效果相似。3.黄柏酮抑制铁死亡的机制研究通过细胞免疫荧光、肺组织免疫组化分析和免疫印迹分析Nrf2的水平和定位。用黄柏酮处理促进了Nrf2的进入细胞核,用Nrf2抑制剂(ML385 30 mg/kg)预处理后ML385显著逆转了黄柏酮对铁死亡、氧化应激和炎症反应的保护作用。我们在有无黄柏酮处理情况下评估了Keap1和Nrf2的蛋白质水平和Nrf2 m RNA水平,发现Keap1蛋白水平以及Nrf2 m RNA水平没有明显的差异。值得主义的是,我们发现在使用黄柏酮处理后Nrf2泛素化降解减少。综上,我们的研究结果显示黄柏酮通过泛素-蛋白酶体途径抑制Nrf2泛素化并减少其降解,从而起到的抗氧化作用减轻脂多糖诱导的小鼠肺炎性损伤。结论:我们的研究表明,黄柏酮通过降低脂多糖导致的肺组织中ROS和MDA的产生,降低了小鼠肺湿/干重比(W/D),以及肺组织中SOD和GSH等氧化指标的消耗,显著减轻了脂多糖诱导的小鼠肺的氧化损伤。此外,黄柏酮显著减轻了肺组织病理损伤,降低了炎症细胞因子的分泌、Fe~(2+)和4-HNE水平,并上调了GPX4、SLC7A11和Nrf2的表达。在机制上,黄柏酮通过抑制Nrf2的泛素化蛋白酶体降解来激活Nrf2,Nrf2抑制剂ML385可逆转黄柏酮对脂多糖诱导的ALI的保护作用。综上,黄柏酮通过Nrf2途径抑制铁死亡,进而发挥对急性肺损伤的保护作用,使其成为一种潜在的急性肺损伤治疗药物。