黑色素瘤(Melanoma)是一种高度恶性的皮肤肿瘤,其治疗药物的发展仍面临着巨大挑战。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一种阳离子多肽,可以通过多种作用机制抑制肿瘤生长。近些年,已经有抗菌肽(如LTX-315、LL-37)作为黑色素瘤的治疗药物进入到临床试验阶段。Polybia-CP(CP)是黄蜂毒液中分离纯化得到的含有12个氨基酸的α-螺旋抗菌肽。在前期工作中,本课题组对CP进行了氨基获悉更多酸的替换以及引入线粒体靶向基团(3-丙羧基)三苯基溴化膦((3-Carboxypropyl)Triphenylphosphonium Bromide),TPP)得到了一系列类似物,通过初步的抗癌活性评价筛选出了具有高抗肿瘤活性的先导化合物CP-59。CP-59在一次瘤内给药(1mg/只)之后的肿瘤治愈率可以达到62.5%,并且在60天内没有复发。CP-59的治疗效果显著高于已经进入到临床实验的抗菌肽LTX-315。本论文主要对CP类似物CP-59和CP-15的抗肿瘤机制进行了研究。本论文首先对抗菌肽的膜裂解活性进行了研究。实验结果表明CP-59在高浓度(40μM)下可以快速引起B16F10细胞变圆、溶胀以及破裂,染料碘化吡啶(Propidium Iodide,PI)进入到细胞内,细胞死亡表现出典型的坏死特征。在低浓度下,CP-59需要更长的时间才能杀死细胞。尽管CP-15在长时间孵育之后表现出高效的抗肿瘤活性,但是短时间内的杀细胞活性显著低于CP-59。这可能是因为过高的疏水性导致CP-15的膜裂解活性下降。本论文研究了CP-15和CP-59对线粒体的损伤。线粒体溶胀实验结果说明CP-15和CP-59都能够对分离的线粒体造成损伤。流式细胞术实验的结果表明异硫氰酸荧光酸(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)标记的CP-15和CP-59在低浓度下(5μM)可以进入到细胞内,CP-59具有更高的穿膜效率。激光共聚焦实验的结果表明FITC标记的CP-59可以进入到线粒体内。这表明CP-59可以靶向细胞内线粒体。当CP-59作用B16F10细胞之后,可以导致线粒体膜电位的下降、线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和细胞质ROS的升高、细胞质腺苷mid-regional proadrenomedullin三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)的下降。线粒体的损伤可能会诱导细胞凋亡的发生,因此本论文又研究了CP-15和CP-59对细胞内天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Cysteine-dependent Aspartate-specific Proteases-3,Caspase-3)活性的影响。实验结果表明CP-59比CP-15更能提高Caspase-3的活性,而其拮抗剂Z-VAD-FMK可以降低CP-59引起的细胞毒性。这表明CP-59可以引起线粒体依赖性细胞凋亡。此外,RIP1蛋白的抑制剂Nec-1并不能显著降低CP-15和CP-59的细胞毒性,这说明程序性坏死不是CP-15和CP-59产生细胞毒性的主要原因。此外,本论文还对CP-59的体内抗肿瘤机制进行了初步的研究。在B16F10小鼠黑色素瘤模型中,研究结果表明右侧肿瘤给与CP-59治疗之后,可以显著降低左侧肿https://www.selleck.cn/products/Puromycin-2HCl.html瘤的生长。这说明CP-59可能激活全身性抗肿瘤免疫反应,抑制远端肿瘤的生长。总之,本论文的实验结果表明CP-59在高浓度下可以快速破坏细胞膜而导致细胞坏死。此外,CP-59在低浓度下可以进入到细胞的线粒体,通过损伤线粒体引起细胞凋亡,未引起明显的程序性细胞坏死。体内抗肿瘤实验结果表明CP-59不仅可以直接杀死细胞而抑制黑色素瘤的生长,还可能激活全身性抗肿瘤免疫反应抑制肿瘤生长。本论文的实验结果进一步证明CP-59可以成为潜在的肿瘤治疗先导化合物。