皮质醇是人类主要的糖皮质激素,在应激生理适应、能量动员和免疫反应的调节中起着至关重要的作用,也被用作合成其他糖皮质激素的中间体。皮质醇的化学法合成涉及步骤繁多且收率低,在目前的工业生产中主要采用半合成方法,其中向11-脱氧皮质醇引入11β-OH生产皮质醇主要用真菌培养物进行微生物转化。然而,真菌催化过程的选择性较差,常伴随着其他位置羟基化副产物的产生,且培养和转化时间均较长。因此,开发替代生物催化剂以更专一且更高效地将11β-羟基引入合成糖皮质激素中,极具工业应用价值。本文以人源线粒体11β-羟化酶P450CYP11B1为研究对象,构建了大肠杆菌重组表达系统用于高效生物催化生成皮质醇,从重组蛋白外源表达条件和全细胞反应条件优化、P450氧化还原伴侣工程和蛋白质分子改造等方面出发,进行了一系列酶工程方向的应用基础研究。为了解决高等真核生物来源P450系统在原核生物外源表达过程中存在的表达量低和稳定性差等问题,首先对CYP11B1及其同源氧化还原伴侣牛AdR和牛Adx在大肠杆菌中的表达载体和多顺反子表达顺序进行优化。然后,在最适表达载体和表达顺序下,通过调整RBS序列来协调三种蛋白的相对表达强度,筛选出最佳RBS组合。随后,对细胞培养条件进行了单因素优化,包括培养温度、诱导条件和培养基组成等,得selleck产品到最佳培养条件。最后,在全细胞反应体系中,比较了不同细胞膜助渗透剂和底物助溶剂对细胞催化活性的影响,并在优选助溶剂的应用下提升反应体系底物浓度。通过表达和反应条件的优化,成功将皮质醇的时空产率由初始的343.6 mg·L-1·d-1提升至优化后条件下的1470.0 mg·L-1·d-1。随后,对CYP11B1的氧化还原伴侣进行工程改造,以期得到可提升电子传递速率的最佳氧化还原伴侣,从而提升全细胞催化效率。首先将天然自给自足酶P450BM3和P450RhF的还原酶域与CYP11B1进行融合表达,形成人工自给自足P450,但融合酶导致了CYP11B1活性的完全丧失。随后选择不同来源的MK-2206使用方法四组氧化还原伴侣与CYP11B1进行共表达,构建了不同铁氧还蛋白与氧还蛋白还原酶的交叉组合,不同的元件组合显示出了对全细胞催化活性影响的显著差异。最后引入两种不同类型的分子支架CipB和PCNAs,期望通过自组装功能形成高效电子通道,但也未显示出对提升催化活性的正young oncologists向作用。虽然氧还伴侣工程的尝试并未直接提升全细胞催化活性,但证明了氧化还原伴侣元件替换对提升P450酶催化效率的潜力。最后,对CYP11B1进行了分子改造,以期提高其催化活性。基于对CYP11B1分子结构的认识,选定构成底物通道的部分残基,并通过丙氨酸扫描寻找影响底物进出的关键位点。利用理性设计手段对底物结合口袋内的不同区域进行位点改造,以期拉近底物C11和血红素-Fe之间的距离。但这两方面的多个突变体未显示出对活性提升的有利影响,甚至部分突变造成了活性严重丧失。随后通过应用计算设计工具提升了CYP11B1蛋白的可溶性和稳定性,多个突变体表现出催化活性的提升,其中三点突变体M3(S169V/H354D/L463F)使皮质醇的时空产率达到2756.3 mg·L-1·d-1,是目前已知此类生物转化类型获得的最高皮质醇产率的3.3 倍。本项工作显著提升了依赖于CYP11B1的生物催化法对11-脱氧皮质醇进行专一 11-β羟基化生成皮质醇的产率,进一步挖掘了微生物法高效生产皮质醇的潜力。同时,在研究过程中开发的工艺优化、氧化还原伴侣工程和酶工程策略为其他基于P450催化的甾体化合物生物合成提供了参考。