由丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的猕猴桃溃疡病是一种毁灭性的细菌性病害,严重时可以导致整个植株的死亡,限制了猕猴桃产业的健康发展。Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)是革兰氏阴性细菌中广泛存在的关键毒力因子,参与调控病原细菌的致病性。hrpR和hrpS基因作为T3SS的开关是hrp基因簇的重要组成部分,T3SS中效应蛋白的分泌也需要转录因子Hrp R和Hrp S的介导。为了探究T3SS中hrpR和hrpS基因在Psa中的功能,本试验以猕猴桃溃疡病菌强毒性菌株M228为研究对象,从猕猴桃溃疡病菌的全基因组中克隆hrpR和hrpS基因;利用同源重组的方法构建基因hrpR和hrpS的突变菌株,并将突变型菌株与野生型菌株进行生物学功能实验,探究hrpR和hrpS基因在猕猴桃溃疡病菌中的生物学功能;同时将ΔhrpR和ΔhrpS菌株进行高通量转录组测序;采用实时荧光定量PCR对候选基因进行表达量分析,进一步了解hrpR和hrpS对致病性的调控机制。研究结果如下:1、以猕猴桃溃疡病菌野生型菌株M228为供试菌株,根据hrpR和hrpS基因的保守序列,设计特异性引物hrpR-F/R和hrpS-F/R,克隆得到hrpR和hrpS基因,片段大小为1131 bp和1108 bp。生物信息学分析结果表明,Hrp R蛋白包含有一个AAA结构域;Hrp S蛋白包含一个低复杂度区域和一个AAA结构域。基于Hrp S的氨基酸序列构建的系统发育树分析发现该菌株与不同生物型的Psa菌株(ICMP18884、ICMP19072和MAFF212056)可以紧密聚成一簇,明显区分于丁香假单胞其他致病变种。2、利用同Pidnarulex使用方法源重组双交换的方法成功地构建出目的基因的缺失突变型菌株ΔhrpR和ΔhrpS,并与野生型菌株进行生物学功能检测。结果表明,与野生型菌株相比,基因缺失型菌株ΔhrpR和ΔhrpS对寄主植物猕猴桃的致病能力均减CoQ biosynthesis弱;并且丧失了对非寄主植物烟草诱导过敏性坏死的能力;生物膜形成能力减弱;体外生长能力增强;ΔhrpS和ΔhrpR菌株的胞外多糖的产量、群集能力和游动能力无显著性差异。3、为进一步了解hrpR和hrpS对猕猴桃溃疡病菌致病性的调控机制,对ΔhrpR、ΔhrpS菌株及野生型菌株进行高通量转录组测序,结果发现,包括细菌分泌系统(Bacterial secretion system)信号通路、ABC转运体(ABC transporters)信号通路、群体感应(Quorum sensing)信号通路以及蛋白外分泌(Protein export)信号通路等多个通路在hrpR和hrpS缺失后受到显著影响;共同差异表达基因主要富集在与生物膜相关的细胞组分上,并且在共同差异基因中发现与OmpA家族蛋白合成相关的基因(CN228＿07645)在ΔhrpR和ΔhrpS菌株中均显著下调。4、根据转录组测序的数据,并结合生物学功能实验所得的结果,对筛选的候选致病相关基因进行q RT-PCR验证。研究发现,测定T3SS相关基因(hrpL、hrpS和hrpK)、harpin基因(hrpZ)、三型效应子基因(CN228＿04320)、菌毛相关基因(pil W)、生物膜相关基因(CN228＿26180)、生长相关基因selleck合成(rim M)在ΔhrpS菌株中的表达量,ΔhrpS中rim M和pil W基因表达量极显著上调,hrpL、hrpS、hrpK、CN228＿26180基因表达量极显著下调,CN228＿04320基因的表达量显著下调,而hrpZ基因的表达量无显著差异。