马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)感染鸡引起的以严重的免疫抑制、神经症状和快速发病性淋巴瘤为主要特征疾病。MD可作为一种天然肿瘤的生物医学模型。MDV属于疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科中的一员,基因组结构与α疱疹病毒亚型单纯疱疹病毒(HSV)相似。在α疱疹病毒中,UL23基因编码的胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)是与病毒毒力相关的体外复制非必需蛋白,常作为抗疱疹病毒感染的治疗药物靶点以及抗肿瘤治疗中的自杀基因,也是基因工程疫苗研发的重要位点。作为HSV/TKBMS-907351体外的同系物,MDV UL23编码TK的功能仍然未知。本课题为了探究MDV/TK的结构和功能,开展如下研究内容:1.MDV/TK蛋白结构预测分析利用Meg Align和Pymol软件,进行MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK氨基酸序列和三级结构比对,并利用Autodock软件将TK蛋白三级结构与核苷分子及其类似物进行对接分析,再利用POCASA在线软件对5种TK蛋白质表面或内部具有结合配体的合适性质的空腔(活性口袋)进行预测。结果表明这5种TK氨基酸序列同源性较低,但空间构象十分相似,尤其是功能相关氨基酸位点高度保守;通过对5种TK与底物分子胸腺嘧啶核苷(TR)和阿昔洛韦(ACV)对接,潜在的作用位点也高度保守;通过与HSV/TK的活性口袋进行比较分析,发现MDV/TK存在潜在的活性口袋intestinal dysbiosis,底物分子TR可包裹在预测的活性口袋中。由此,我们推测MDV/TK可能发挥与HSV/TK和PRV/TK相似的生物学功能。2.MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PR购买GW4869V/TK蛋白表达及纯化为了验证5种TK是否都发挥酶活性,首先通过构建原核表达质粒,在大肠杆菌种诱导表达MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白。经过优化诱导表达温度及IPTG浓度,SDS-PAGE结果显示MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白均能够在裂解细菌上清中可溶性表达。经GST-tag纯化柱和分子筛纯化,Western blot结果表明成功获得5种高纯度TK蛋白,为验证其体外酶活性打下材料基础。3.MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK体外酶活性验证为进一步验证5种TK的酶活性,首先确定了TK催化反应条件,再以ATP和TR为底物,分别向体系加入MDV-1/TK、MDV-2/TK、HVT/TK、HSV-1/TK和PRV/TK蛋白,37℃反应1 h,利用高效液相色谱(HPLC)检测催化反应产物。结果发现5种蛋白催化反应体系均生成ADP和d TMP。再利用ACV为底物,模拟与TR底物分子相同的反应条件,HPLC检测催化反应产物均为ADP和ACV-MP。这些结果表明MDV-1/TK、MDV-2/TK和HVT/TK均发挥胸苷激酶的活性,能够催化核苷及其类似物发生磷酸化,与HSV-1/TK和PRV/TK酶活性功能一致。综上所述,本研究通过MDV与其他α疱疹病毒编码的TK结构和功能比较分析,揭示了MDV/TK与HSV-1/TK、PRV/TK三级结构及酶功能区结构相似性,证明其作为胸苷激酶的体外催化活性。为进一步探究其参与病毒致病机制和疫苗研发提供了新的思路,也为构建以α疱疹病毒编码的TK为研究靶点的病毒和肿瘤模型打下良好的基础。