背景:膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其首选筛查方法以膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查为主,但存在侵入有创、敏感度差等缺点。尽管已有膀胱癌Sulfonamide antibiotic的生物标志物用于肿瘤筛查,但对于早期膀胱癌仍存在大量漏诊情况。近年来国内外学者不断探索新的筛查手段,以寻求更为安全无创、特异性强、灵敏度高的检查方式RSL3,以提高膀胱癌的诊断率。蛋白质组学和代谢组学研究可以揭示大量蛋白质组及代谢组数据,进而为筛查早期膀胱癌潜在的生物标志物提供技术支持,同时对后续的功能和通路信息研究具有重要的指导意义。第一部分:早期膀胱癌的蛋白质组学分析方法:1.研究者共收集了238份尿液样本(膀胱癌106例,膀胱炎23例,上尿路癌26例,按膀胱癌性别和年龄匹配的健康对照83例),提取其中蛋白质并消化成肽段。2.通过LC-MS/MS方法,用数据独立采集法对尿液样本的蛋白进行采集,并进行定性及相对定量分析。经过对质控分析后去除不合格样本,余下合格样本用于后续分析。3.在队列研究中,比较了膀胱癌、健康对照、膀胱炎及上尿路癌的尿液蛋白质组特征。差异变化≥1.5且P<0.05的蛋白质被认为是差异表达蛋白。通过IPA分析各队列差异蛋白参与通路及功能。4.取各队列间差异蛋白交集作为生物标志物候选蛋白。将所有研究对象重新分为膀胱癌组和对照组,并按比例随机分成实验组和验证组。选取AUC评分最高的3个蛋白组成生物标志物模型,用机器学习中逻辑回归模块分析该模型对膀胱癌的诊断效果,同样的分析方法对验证组进行验证。结果:1.在尿液蛋白质组数据库中,研究者共鉴定出1217个蛋白质。通过质控分析删除不合格样本,余下201例样本进行后续分析(膀胱癌83例,膀胱炎20例,上尿路癌23例,按膀胱癌性别和年龄匹配的健康对照75例)。2.与膀胱癌相比,健康对照、膀胱炎和上尿路癌中差异表达的蛋白质数量分别为325、158和473个。各组间差异蛋白主要参与膀胱癌细胞增殖、代谢、坏死以及信号转导等功能。3.取各队列间差异蛋白交集,共8个蛋白作为生物标志物候选蛋白。选取ROC分析中AUC得分最高的3个蛋白APOL1、ITIH3、ANGPTL6建立生物标志物模型做Logistic回归分析,得到panel的AUC为0.99,灵敏度为96.1%,特异性为96.2%。同样的分析方法对验证组进行验证,发现该模型具有较好的预测效果(AUC=0.99)。第二部分:早期膀胱癌的代谢组学分析方法:1.取本研究第一部分中质控合格的尿液样本158份(膀胱癌83例,健康对照75例),提取其中代谢物质。2.通过LC-MS/MS对尿液样本的代谢物进行采集并进行相对定量分析。选取差异变化≥1.5且P<0.05的代谢物为差异代谢物。对QC样本中的差异代谢物做定性分析,通过与公共数据库比对鉴定代谢物。3.将筛选出的差异代谢物导入Meta Analyst 5.0平台进行功能及通路富集分析。经过ROC分析,选取AUC评分最高的3个代谢物组成生物标志物模型,用逻辑回归模块分析该模型对膀胱癌的诊断效果,用10叠交叉验证方法进行验证。结果:1.在尿液代谢组数据库中,研究者共筛选出399个差异代谢物,其中75个代谢物有鉴定结果。2.膀胱癌与健康对照组间的差异代谢物主要参与氨基酸代谢、脂质代谢、能量摄取及嘌呤代谢等生物过程。3.选取ROC分析中AUC得分最高的3个代谢物精氨酰天门冬氨酸、N-乙酰色氨酸和胆酸葡萄糖苷酸组建立生物标志物模型做Logistic回归分析,得到panel的AUC为0.976,灵敏度为94.5%,特异性为98.5%。10叠交叉验证该模型具有较好的预测效果(AUC=0.959)。第三部分:APOA2的生物信息学分析方法:1.通过查阅TCGA数据库,获得膀胱尿路上皮癌患者的基因表达数据和临床数据。将质谱检测结果中差异表达的载脂蛋白挑选出来,分析其在TCGA数据库中膀胱癌队列中的表达情况。2.综合质谱结果及公用数据库结果,挑选出最具代表的载脂蛋白,查看该蛋白在Timer公用数据库肿瘤组织中表达情况。3.在Pathcards数据库及KEGG中查看该分子参与的潜在通路,从中挑选关键通路,分析该分子在通路内参与的生物学进程。结果:1.蛋白质组学中鉴GSK2118436定到14种载脂蛋白,其中5种蛋白具有表达差异。2.在TCGA数据库中,APOA2的表达差异最大;在Timer数据库的膀胱癌队列中,APOA2的表达趋势与TCGA数据库中一致。3.在Pathcards数据库中,APOA2共参与15条信号通路,其中PPAR信号通路与膀胱癌最为相关。KEGG显示APOA2参与脂质转运及脂质代谢功能。第四部分:APOA2在尿液与组织中的表达情况及其对膀胱癌细胞的生物学影响方法:1.用ELISA方法检测APOA2在尿液中表达情况,Western Blot及免疫组化方法检测APOA2在组织中表达情况。2.通过选取人膀胱尿路上皮癌细胞T24和UM-UC-3,构建APOA2过表达和沉默表达的稳转细胞株,用RT-q PCR及Western Blot检测转染效率。3.通过细胞功能实验检测APOA2表达量的变化对膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。结果:1.APOA2在膀胱癌患者的尿液与组织中均表现为上调,验证了质谱及生信分析的结果。2.RT-qPCR及Western Blot检测到T24和UM-UC-3过表达和沉默表达APOA2的稳转细胞系构建成功。3.细胞功能实验表明APOA2过表达促进细胞的增殖、迁移及侵袭功能,沉默APOA2可抑制细胞增殖、迁移及侵袭功能。通过以上研究,我们得出以下结论:1.蛋白质和代谢物可以反映早期膀胱癌病理生理变化,可选取其中重要分子做为筛查早期膀胱癌的生物标志物。2.载脂蛋白深度参与了膀胱癌的发病机制,尿液蛋白质组学及代谢组学可以反映出肿瘤发生的多种生理病理变化。3.APOA2在膀胱癌患者尿液与组织中高表达。4.APOA2表达上调可促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能,可作为膀胱癌诊断的潜在生物标志物。