桑树为多年生落叶乔木,是我国重要的经济树种,有着悠久的种植历史和广泛的种植范围。随着桑树多元化利用的发展,桑树除了在传统养蚕中作为主要饲料外,逐渐在医疗、食品、能源和畜牧等领域发挥重要作用。桑树含有大量的次生代谢产物,如类黄酮和木质素,两者均是苯丙烷代谢通路的主要次生代谢产物,有着一致的前期合成通路。类黄酮,具有抗氧化活性、清除自由基的能力,还具有巨大的药用价值;木质素在构成植物第一道防线的同时,还是影响饲料可消化率和生物原料转化率的重要因素。为更深入了解类黄酮和木质素合成途径中关键基因对其合成与积累的调控机制、两合成通路间潜在的相互作用,本文以‘中椹1号’、‘绿椹子’和‘丰驰桑’为材料,通过生物信息学分析、RT-q PCR、VIGS等方法进行相关研究,取得以下主要结果:1.在‘中椹1号’和‘绿椹子’中克隆到2个MaDFRs全长,都偏好在果实中表达。多序列比对发现与MaDFR1相比,MaDFR2在5’端缺失105个氨基酸。经HPLC和酶学分析结果显示,MaDFR1对三种二氢黄酮醇均具有催化活性,优先催化二氢槲皮素和二氢杨梅素;而MaDFR2因在5’端缺失NADPH结合基序,从而不具备催化二氢黄酮醇活性。利用VIGS技术在桑树幼苗中下调MaDFR1表达水平能够抑制总黄酮的积累。2.以川桑基因组为基础筛选了桑树中CCR基因家族成员,并克隆得到4个MaCCRs全长,并且4个MaCCRs转录水平具有组织偏好性。系统发生分析发现,聚类在不同分支的MaCCRs在催化功能上存在差异。体外酶学分析表明,只有聚类在bona fide分支的MaCCR1具有催化羟基肉桂酰辅酶A的活性,优AY-22989采购先催化阿魏酰辅酶A生成松柏醛。通过体内功能验证表明,桑树茎叶中MaCCR1的表达水平与其木质素积累量呈显著正相关,下调MaCCR1表达水平,能够显著降低桑树茎叶中木质素含量。通过下调MaCCR1表达水平降低木质素含量的同时,其茎叶中花青素的含量显著提高。3.筛选并克隆到5个MaCADs序列全长,其中MaCAD3和MaCAD4偏好在茎中表达,并且编码完全一致的氨基酸序列。系统发生和酶学分析表明,MaCADs均能体外催化羟基肉桂醛生成羟基肉桂醇,MaCAD3www.selleck.cn/products/d-lin-mc3-dma和MaCAD4表现出与大多数双子叶植CAD相同的底物偏好性,优先催化松柏醛和芥子醛。通过桑树体内功能验证发现,MaCAD3和MaCAD4是主要参与木质素合成的CAD,其表达水平与木质素含量显著正相关,下调其表达水平,能够显著降低桑树茎叶中木质素含量。同时下调MaCCR1和MaCAD3/4表达水平时能够导致木质素含量的降低,但是植株出现矮化现象,造成整体生物量的降低。通过上述结果,确定了桑树中MaDFR1是直接参与类黄酮生物合成通路的关键基因,MaDFR1对三种二氢黄酮醇的催化活性保证了花青素种类丰富,但并非直接影响桑椹颜色表型的决定因素;桑树中MaCCR1、MaCAD3和4是主要参与木质素生物合成的对应家族成员,成功通过下调该基因在桑树体内的表达水平,下调Digital PCR Systems木质素的积累量,并且证明降低木质素合成通路代谢流量会导致类黄酮合成通路的代谢流量增加,为桑树遗传育种提供优良的靶基因和理论基础。