目的:研究中国弯颈霉提取液(TSE)辅助环磷酰胺治疗肺癌的增效减毒作用,期望可以为临床肿瘤的治疗提供中西医结合方法的实验依据。方法:(1)应用网络药理学的方法,在TCMSP数据库中查询并获取冬虫夏草的活性成分(由于各平台并未对冬虫夏草的有性型及无性型进行区分,所以在实际操作过程中仍使用“冬虫夏草”进行检索);并从该数据库以及STP(Swiss Target Prediction)数据库中获取各活性成分的作用靶点信息。后利用OMIM、Drug Bank及Gene Cards数据库获得肺癌相关靶点,与之前获取的活性成分靶点进行比较,两者共同部分即为冬虫夏草治疗肺癌的潜在作用靶点。在STRING平台建立作用靶点之间的PPI图,确定潜在核心靶点。利用Metascape数据库对上述得到的核心靶点进行富集分析(GO富集分析及KEGG通路分析)。最后通过分子对接进行靶点自发结合模拟。(2)(1)体外使用DMEM高糖培养基培养小鼠Lewis肺癌细胞(LLC细胞),使用CCK-8、流式细胞术、Transwell等方法对TSE在体外对LLC细胞作用进行研究,包括细胞活性、克隆原形成、细胞周期、凋亡以及侵袭、转移能力等。(2)蛋白质印迹法检测细胞筛选得到的核心通路相关蛋白的表达,对网络药理学预测结果进行验证。(3)BALB/c小鼠随机分5组:正常组(Control组)、荷瘤模型组(Model组)、低剂量组(TSE-180 mg/Kg组)、高剂量组(TSE-360 mg/Kg组)、顺铂组(CDDP组)。除Control组小鼠外,其余四组在小鼠Trichostatin A体内实验剂量右侧前肢腋下皮下移植肿瘤细胞,建立小鼠皮下移植瘤模型。TSE及CDDP治疗组连续给药两周。给药结束后分别检测五组小鼠体重、脏器(脾脏及胸腺)重量、肿瘤体积,计算有效体重、有效体重变化、器官指数及抑瘤率;检测小鼠外周血WBC、RBC以及PLT数目;H&E染色分别检测小鼠脾脏、胸腺、骨髓以及肿瘤组织结构;TUNUL染色检测小鼠骨髓及肿瘤凋亡细胞数目。(3)BALB/c小鼠随机分4组:正常组(Control组)、模型组(Model组)、低剂量组(TSE-180 mg/Kg组)、高剂量组(TSE-360 mg/Kg组)。除Control组小鼠外,其余三组连续腹腔注射CTX三天,建立小鼠免疫抑制模型。TSE治疗组连续给药十天。给药结束后分别检测四组小鼠体重、脏器(脾脏及胸腺)重量,计算器官指数;H&E染色分别检测小鼠脾脏、胸腺、骨髓结构。(4)BALB/c小鼠随机分为4组:皮下荷瘤模型组(Model组)、环磷酰胺治疗组(CTX组)、TSE高剂量组(TSE-360 mg/Kg组)、联合用药组组(CTXTSE-H组)。所有小鼠右前肢腋下皮下移植肿瘤细胞,建立小鼠皮下移植瘤模型。治疗组连续给药两周。给药结束后分别检测4组小鼠体重、脏器(脾脏及胸腺)重量、肿瘤重量,计算有效体重、有效体重变化、脏器指数及抑瘤率;检测小鼠外周血WBC、RBC以及PLT数目;H&E染色分别检测小鼠肝脏、肾脏。结果:(1)筛选得到22个有效成分,共可作用于490个靶点;其中与肺癌相关的165个,关键靶点11个,涉及多条通路。分子对接结果显示6个核心成分和12个肺癌核心靶点均可自发性结合。(2)(1)TSE在体外对LLC细胞增殖、凋亡均无影响;TSE可使处于S期和G2/M期的细胞比例增高,G1期细胞比例降低;可显著抑制LLC细胞的侵袭、转移行为。(2)TSE可以减少PI3K蛋白的表达,增加Akt蛋白表达。(3)小鼠体重结果显示,与Model组相比,TSE-H组小鼠有效体重及有效体重变化显著改善。根据肿瘤抑制率计算公式计算可得,TSE低剂量组、TSE高剂量组及CDDP组的抑瘤率分别为6.01%、40.46%、61.09%,高剂量TSE可有效抑制小鼠Lewis肺癌的生长。外周血检测结果显示,Model组RBC及PLT显著降低,TSE治疗后有效缓解。脏器指数结果显示:Model组小鼠脾脏增大,脾指数增大,TSE组脾脏指数与Control组无差异;Model组胸腺指数显著降低,TSE组胸腺指数与Control组无差异;小鼠脾脏、胸腺、骨髓及肿瘤H&E结果表明:Model组小鼠脾脏组织结构疏松、脾小结轮廓模糊,TSE-H组小鼠脾脏组织形态完整,结构紧密脾小结轮廓清晰;胸腺组织结构差异不大;Model组骨髓破坏较严重,TSE组骨髓较完整。TUNEL染色结果显示,Model组与CDDP组小鼠骨髓凋亡细胞较多,TSE组凋亡细胞较少,且随剂量的增加,凋亡细胞数减少;Model组肿瘤出现少量凋亡细胞,TSE组与CDDP组肿瘤细胞凋亡情况均显著升高。(3)免疫组小鼠体重结果显示,与Control组相比,其余三组小鼠注射CTX期间体重快速降低,TSE干预对小鼠体重无明显影响。(2)小鼠脾指数及胸腺指数检测结果显示,与Control组相比,Model及TSE治疗组脾脏指数均无差别;Model组胸腺指数显著降低,TSE治疗后胸腺指数显著上升,且与Control组无差别。(3)小鼠脾脏、胸腺及骨髓H&E结果表明:Model组小鼠脾脏组织结构疏松、脾小结轮廓模糊,TSE-H组小鼠脾脏组织形态完整,结构紧密脾小结轮廓清晰;胸腺组织结构差异不大;Model组骨髓破坏较严重,TSE组骨髓较完整。第三章:中国弯颈霉提取液联合环磷酰胺治疗肺癌的增效减毒作用研究(4)(1)小鼠体重结果显示,与CTX组相比,联合用药组小鼠有效体重、有效体重变化显著回升。(2)肿瘤抑制率结果显示,CTX组、TSE-H组及CTX-infant infectionTSEH组的抑瘤率分别为3.18%、39.07%、41.45%,TSE联合用药可增强CTX的抗肿瘤效果。(3)血常规结果显示,CTX组小鼠WBC、RBC、PLT出现显著降低,联合TSE治疗WBC及RBC与模型组无差别。(4)脾脏、胸腺指数结果显示,CCobimetinib化学结构TX组小鼠脾脏出现显著硬化、肿大现象;TSE-H组及联合用药组脾指数降低;与CTX组相比,联合用药组胸腺指数显著增大。(5)肝肾H&E染色结果显示,联合用药明显减轻CTX的肝肾毒性。结论:网络药理学共筛选得冬虫夏草多个有效成分,并可作用于涉及多条通路的多个肺癌相关靶点,为多成分-多靶点-多通路作用。验证实验显示,TSE可在体外显著抑制LLC细胞侵袭、迁移等行为,并可在体内通过增强免疫起到抗肿瘤作用;与CTX联合使用在增强CTX的抗肿瘤效果的同时,可减轻CTX对机体血象及肝肾的毒副作用,总体可起到增效减毒的作用。