羰基还原酶属于氧化还原酶的第一亚类,广泛存在于细菌、真菌、酵母、植物和动物体内,是一类具有广泛的底物特异性的细胞质酶。羰基还原酶可在辅酶NAD(P)H存在的条件下,催化一系列羰基化合物如脂肪酮、芳香酮类、醛类等不对称还原得到相CL13900溶解度应的手性醇。手性醇含有手性羟基官能团,是有机合成中重要的手性砌块,广泛应用于医药中间体、精细化工等领域。以羰基还原酶不对称还原制备手性醇的生物催化法具有巨大的工业应用潜力。本课题组在前期研究中构建了重组菌E.coli BL21(DE3)/p ACYC Duet-1-cpcr,在此基础上,本研究对羰基还原酶Cp CR进行分子改造以拓展其底物谱,增强其对目标底物的催化效率。通过易错PCR构建随机突变文库,2,4-二硝基苯肼(DNPH)高通量筛选酶催化苯乙醛(PAAH)、(4-氯苯基)(2-吡啶基)甲酮(CPMK)等酮基底物的突变体。以计算机辅助设计对酶进行分子改造研究。定点突变构建突变体酶。探究突变体的酶学性质,包括酶的催化活性、热稳定性、动力学参数等。并考察了催化时间、温度、p H、底物浓度、葡萄糖浓度以及有机助溶剂等因素对酶催化转化PAAH/CPMK的影响。主要实验结果如下:(1)建立了羰基还原酶Cp CR活性的高通量筛选方法,即通过羰基显色剂DNPH与含有羰基的底物反应生成红棕色沉淀这一特征反应来进行高通量筛选,并将其应用于还原酶Cp CR分子改造过程中突变文库的筛选。(2)羰基还原酶Cp CR催化PAAH的分子改造:通过Discovemonitoring: immunery Studio软件将羰基还原酶与PAAH进行分子对接,分析酶与底物结合关键氨基酸位点,结合易错PCR筛选的正突变位点,进行氨基酸替换、虚拟饱和突变、计算突变能。选择突变能最低的氨基酸进行定点突变构建S50N、Q60W、A97K、L165D、T171F、P284E和L309W突变体。酶学性质研究表明突变体T171F和L165D酶活力分别为11.46 U/mg和11.96U/mg,相比wt Cp CR分别提高了10.14%和12.86%。动力学参数实验表明羰基还原酶wt Cp CR及其突变体对PAAH的亲和力均较高,其中T171F的催化效率为wt Cp CR的2倍。酶的热稳定性实验中,T171F的t_(1/2)提升至28 h相比wt Cp CR提升7 h;T171F的T_(50)值为37℃,比wt Cp CR提高1℃。催化合成2-苯乙醇(2-PE)产率分析实验表明,T171F的产率分别为91.31%,相比wt Cp CR分别提高了2.36倍。表明突变体T171F具有更强的催化能力和热稳定性。考察突变株T171F与wt Cp CR催化合成2-PE影响因素实验表明:酶最适催化温度为30℃;T171F最适p H为6.5,wt Cp CR最适p H为7.0;PAAH浓度为1000 mg/L时,T171F产率可达90%以上,wt Cp CR则只有31.7%。最佳葡萄糖添加量为2.0 g/L;底物浓度为2000 mg/L时,T171F在5%(V/V)的二甲基亚砜溶剂中产率最高,可达85.08%,是未添加有机助溶剂时产率的3.1倍。且突变体T171F相比wt Cp CR催化时间由10 h降低到4 h,催化效率得到很大的提高。(3)羰基还原酶Cp CR催化CPMK的分子改造:通过高通量筛选获得的突变位点,结合计算机辅助设计,定点突变构建突变体酶A97N、A121N、K289D、P284E/P285D和P284D/P285W。酶学性质研究表明突变体P284D/P285W的酶活力为0.6266 U/mg,是wt Cp CR的3.42倍。动力学参数实验表明羰基还原酶wt Cp CR及其突变体对CPMK的亲和力均较低,催化效率是wt Cp CR的6.2倍。酶的热稳定性实验中,A97N的t_(1/2)提升至24 h相比wt Cp CR提升2 h;P284D/P285W的T_(50)值为38℃相比wt Cp CR提高2℃。催化CPMK合成(S)-(4-氯苯基)(2-吡啶基)甲醇[(S)-CPMA]的实验表明,P284D/P285W的转化率为22.34%,是wt Cp CR的4.35倍。但其e.e.值降低至81.09%。突变体P284D/P285W具有更强的催化能力和热稳定性。考察突变株P284DBMS-354825分子式/P285W与wt Cp CR催化CPMK的影响因素实验表明:wt Cp CR最适催化温度为32℃,P284D/P285W为36℃;且当温度超过36℃时,酶的立体选择性会降低,e.e.值减小。酶最适催化p H为7.5,p H的变化对e.e.值无影响;当底物CPMK浓度为100 mg/L时,P284D/P285W的转化率可达42.71%,wt Cp CR则只有10.25%。最佳葡萄糖添加量为3.0 g/L。而且突变体P284D/P285W相比wt Cp CR催化时间由8 h降低为6 h,催化效率有一定的提高。