近年来随着社会压力增加、生育年龄延后及环境污染加剧,不孕症的发病率不断升高,全球约有10～15%的育龄夫妇遭受不孕症的困扰。不孕不育已成为影响人类健康的重大疾病,对家庭幸福及社会和谐发展造成严重影响。作为治疗不孕症的常规手段,辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)的广泛应用为众多不孕家庭带来了新生命。但是,ART获得的胚胎中约10%阻滞在早期卵裂阶段,临床诊断为早期胚胎停滞(Early embryonic arrest,EEA)。EEA是导致ART失败的重要原因,但目前临床上难以早期发现,亦缺乏有效治疗手段。因此,探寻EEA的发生原因,研究其致病机制并探索精准干预策略具有重要意义。获得成熟卵子是实现正常受精、维持早期胚胎发育的重要前提。在卵子成熟和早期胚胎发育过程中发生众多关键生物学事件,如减数分裂、母源RNA降解以及合子基因组激活等。上述任一事件发生异常均可导致EEA。近年来,随着全外显子组测序技术(Whole-exome sequencing,WES)的成熟和普及,基于EEA家系的WES研究发现了一系列新的致病基因,包括卵母细胞减数分裂调控基因MOS、皮质下母源效应复合体组分基因(PADI6、TLE6、KHDC3L、NLRP2、NLRP5)、细胞骨架基因TUBB8以及母源RNA降解相关基因BTG4等,为EEA遗传病因学研究开拓了新的思路。NLRPs家族在先天免疫和生殖系统发育及功能调控中发挥关键作用。已发现的EEA致病基因NLRP2、NLRP5均属于NLRPs家族,提示NLRPs家族成员在早期胚胎发育调控中可能发挥重要作用。NLRP14在性腺中特异性表达,既往有报道严重少弱精和无精症患者携带NLRP14基因突变,Nlrp14基因缺陷亦可导致雄鼠精子发生障碍,表明NLRP14基因参与精子发生发育过程;另有研究报道在体外培养的小鼠受精卵中沉默Nlrp14后,胚胎发育阻滞在1～8细胞期,但缺乏具体机制的解析。因此,NLRP14在卵子成熟、早期胚胎发育中的作用机制以及与不孕不育的相关性有待进一步探究。目的阐明NLRP14在卵子成熟及早期胚胎发育中的作用和机制,并探索NLRP14基因突变在临床EEA患者中的致病性及相关机制。方法第一章中,为了阐明NLRP14在卵子成熟及早期胚胎发育中作用,我们首先在小鼠不同器官组织、不同发育阶段的卵及早期胚胎通过WB、IF和qPCR等检测明确NLRP14 mRNA和蛋白水平的表达及定位;借助CRISPR/Cas9技术构建Nlrp14基因敲除的小鼠,观察Nlp14-/-雌鼠的生育表型,明确Nlrp14缺失对雌鼠生育力的影响;采用体外受精早期胚胎培养和卵子体外成熟等技术,观察Nlrp14缺失对卵子成熟和购买GSK126早期胚胎发育的影响;通过免疫荧光观察纺锤体、染色体、线粒体、胞质晶格结构及染色质状态,评估Nlrp14缺失对卵子质量的影响;根据卵母细胞IP-MS探寻NLRP14互作蛋白并进行验证;通过比较野生型和Nlrp14-/-雌鼠卵母细胞蛋白质组差异,探究Nlrp14缺失对卵母细胞蛋白表达谱的影响;对GV期卵母细胞、MII期卵母细胞、受精卵及2-细胞进行RNA-seq分析,观察Nlrp14缺失对母源RNA转录、降解及合子基因组激活的影响,从而明确Nlrp14缺失影响卵子成熟和早期胚胎发育的作用机制。第二章中,为了明确NLRP14基因突变是否与临床EEA发生相关,我们在EEA患者中进行NLRP14基因突变筛查,寻找可能的致病变异。为了阐明潜在致病变异的致病机理,首先借助体外细胞实验过表达UHRF1和野生型及突变型NLRP14的载体,比较野生型及突变型NLRP14蛋白与UHRF1蛋白的互作情况;进一步使用卵母细胞显微注射技术,在卵母细胞中过表达野生型及突变型NLRP14的mRNA,比较野生型及突变型NLRP14对卵母细胞UHRF1蛋白表达水平的影响,最终明确突变对NLRP14蛋白功能的影响。结果一.NLRP14在卵子成熟及早期胚胎发育中的作用和机制研究1.NLRP14在卵子成熟及早期胚胎发育中的表达和定位对野生型雌鼠各器官组织进行NLRP14 mRNA和蛋白表达检测,发现NLRP14在卵巢特异性表达,在子宫、肝脏、肾脏、脾脏和肌肉等组织中不表达。对卵巢、Transfusion-transmissible infections卵母细胞及早期胚胎进行检测,发现Nlrp14 mRNA在卵母细胞特异性表达,受精后明显下降;NLRP14蛋白在始基卵泡卵母细胞开始表达,随卵母细胞发育成熟,其表达不断积累,且在成熟的卵母细胞及早期胚胎中主要富集于皮质下区域。不同于mRNA水平的变化,NLRP14蛋白在受精后各早期胚胎发育阶段仍维持高表达。对人NLRP14的表达进行探究,发现其亦在人卵母细胞及早期胚胎中特异性表达,该特异性的表达模式提示NLRP14为母源效应因子,可能在卵子成熟及早期胚胎发育中发挥重要作用。2.NLRP14在卵子成熟及早期胚胎发育过程中的作用构建Nlrp14基因敲除小鼠,卵巢及卵母细胞蛋白水平验证Nlrp14基因敲除成功。Nlrp14-/-小鼠一般表型未见异常,生育力观察发现雌鼠完全不孕。超排后取卵进行体外受精及早期胚胎培养观察,发现Nlrp14-/-雌鼠卵母细胞受精率显著下降,胚胎发育至2-细胞的比率降低,未见发育至4-细胞的胚胎,表现为1～2-细胞阻滞。Nlrp14-/-雌鼠卵巢大体观正常,各级卵泡均存在,排卵数未见明显差异。卵母细胞体外成熟观察发现Nlrp14-/-雌鼠卵母细胞GVBD率无明显变化,PB1排出率显著降低,提示卵子成熟障碍。此外,对卵母细胞体内成熟情况观察,同样发现Nlrp14-/-雌鼠卵母细胞PB1排出率下降,MⅡ比率降低,提示Nlrp14基因敲除导致卵子成熟障碍,受精异常及EEA。3.Nlrp14基因敲除影响卵子成熟及早期胚胎发育的机制对排出PB1卵母细胞中纺锤体和染色体进行观察,发现Nlrp14-/-雌鼠约50%的卵母细胞纺锤体组装存在显著异常,约85%的卵母细胞存在染色体结合、排列和分离等方面异常。此外,发现Nlrp14-/-GV期卵母细胞线粒体分布异常、胞质晶格结构缺失及核仁环绕型(Surrounded nucleolus,SN)卵母细胞比例显著降低,说明Nlrp14基因敲除导致卵母细胞减数分裂成熟障碍,影响卵母细胞质量。为进一步明确作用机制,我们通过卵母细胞IP-MS鉴定NLRP14互作蛋白,发现主要涉及纺锤体组装微管相关蛋白、皮质下母源复合物(Subcortical maternal complex,SCMC)蛋白、甲基化相关蛋白和转录相关蛋白。对比野生型和Nlrp14-/-卵母细胞蛋白质组学差异,发现微管相关蛋白和甲基化相关蛋白表达显著下调。通过WB证实Nlrp14-/-卵母细胞中微管相关蛋白(TUBB3,TUBA1,TUBA4A)显著降低,与其纺锤体组装异常表型一致。对于SCMC组分蛋白,发现其虽与NLRP14互作且共定位于卵母细胞皮质下区域,但是Nlrp14缺失并不影响SCMC复合物的组装,提示SCMC不是Nlrp14缺失导致EEA的机制。对于IP-MS中NLRP14互作蛋白中丰度最高的蛋白UHRF1,发现其同时也是Nlrp14-/-卵母细胞中表达水平降低最显著的蛋白。卵母细胞的Co-IP证实NLRP14与UHRF1之间存在互作,且经WB和IF验证发现UHRF1在Nlrp14-/-卵母细胞表达显著下降。为进一步明确NLRP14对UHRF1的调控作用,在Nlp14-/-卵母细胞体外成熟培养液中应用蛋白酶体抑制剂,可升高UHRF1蛋白水平,提示NLRP14可与UHRF1互作从而保护UHRF1免受蛋白酶体途径依赖的降解。为明确Nlrp14基因敲除对RNA转录、降解及合子基因组激活的影响,对野生型和Nlrp14-/-GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、PN5期受精卵(Nlrp14♀-/♂+)和2-细胞胚胎(Nlrp14♀-/♂+)进行转录组测序分析,发现MII期卵母细胞差异基因富集在细胞骨架、纺锤体组装、染色体分离、mRNA加工和转录、线粒体分布和细胞周期等通路,与卵子成熟障碍表型一致,卵子质量下降机制一致。通过对比母源合子过渡(Maternal-zygotic transition,MZT)过程中,母源RNA降解基因与异常上调基因,以及合子基因组激活基因与异常下调基因,发现Nlrp14基因敲除影响MZT中母源RNA的Z-降解及合子基因组激活,从而导致减数分裂成熟障碍、受精障碍及EEA。二.NLRP14基因突变在EEA发生中的作用研究1.在临床EEA患者中发现NLRP14复合杂合突变在606例EEA患者中发现一例患者携带NLRP14复合杂合突变:移码突变c.1282_1283delTG(p.Cys428Profs*28)和缺失-插入Y-27632溶解度突变 c.2660delinsGCTA(p.Leu887delinsArgTyr)(NM_176822.4)。经 Sanger 测序验证符合隐性遗传模式。在gnomAD外显子组数据库对突变的频率进行检索,结果显示移码突变为低频突变,缺失-插入突变未被报道。2.突变型NLRP14蛋白的功能研究第一部分机制研究发现在卵母细胞中NLRP14可与UHRF1结合,且Nlrp14基因敲除导致卵母细胞UHRF1表达降低,因此,我们主要探究NLRP14突变是否影响与UHRF1的蛋白互作及UHRF1表达。体外细胞过表达实验证实突变型NLRP14与UHRF1的互作完全丧失或显著降低。借助卵母细胞内显微注射实验,发现相较于野生型NLRP14,注射突变型NLRP14 mRNA后卵母细胞UHRF1蛋白表达明显降低。以上结果提示NLRP14突变影响了 NLRP14与互作蛋白UHRF1的结合并导致其表达降低。结论Nlrp14基因敲除导致小鼠卵子质量受损,微管蛋白表达下调,影响与UHRF1的互作,引起UHRF1表达降低,母源RNA的Z-降解以及合子基因组激活异常,从而造成卵母细胞减数分裂成熟障碍、受精障碍及EEA,最终导致雌鼠不孕。本研究首次在EEA患者中发现NLRP14复合杂合突变,影响NLRP14蛋白功能,证实NLRP14基因突变为EEA的致病原因,为临床EEA的机制解析以及精准干预提供依据和靶点