研究目的:本研究探索蒺藜止痒方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠的治疗作用以及对皮肤屏障功能的影响;且基于网络药理学分析及实验验证蒺藜止痒方治疗银屑病的潜在分子作用机制,为研究治疗银屑病疗效确切的中药复方奠定基础。研究方法:1.先将6只BALB/c小鼠分为空白对照组和模型对照组,参考相关文献进行造模处理,造模完成后,将IMQ诱导的银屑病模型小鼠的皮肤组织做病理学观察,于光镜下发现银屑病的特征性病理表现:Munro微脓肿的形成,则提示造模成功。2.将60只BALB/c小鼠随机分为空白对照组(Blank)、模型组对照组(Model)、阳性对照组(Positive)、蒺藜止痒方低浓度组(J-L)、蒺藜止痒方中Bioactivity of flavonoids浓度组(J-M)、蒺藜止痒方高浓度组(J-H),以口服给药7天,期间记录小鼠的饮食、活动等一般情况,称取小鼠体重并记录体重变化趋势,观察小鼠背部皮损情况,获得脏器数据变化,记录模型小鼠的银屑病皮损面积和严重程度指数(PASI)评分,做小鼠皮肤的组织病理学形态观察,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子IL-17A和TNF-α的表达量,检测并记录小鼠皮肤表面含水量,用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测FLG的相对表达量等指标,以探究蒺藜止痒方对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的治疗作用以及对皮肤屏障功能的影响。3.通过网络药理学的研究方法,运用TCMSP数据库筛选蒺藜止痒方的有效成分,并收集其相应的作用靶点;使用Gene Cards、OMIM、Drug Bank、Pharm Gkb、TTD数据库筛选与银屑病相关的基因靶点,并用在线韦恩图平台将蒺藜止痒方作用靶点与银屑病基因取交集,获得蒺藜止痒方治疗银屑病的靶点基因;利用STRING数据库构建PPI网络,采用Cytoscape 3.8.0软件构建“蒺藜止痒方-有效成分-靶基因-银屑病”相互作用网络,并筛选出核心作用靶基因,然后对潜在治疗靶点进行基因GO的富集分析和KEGG的代谢通路富集分析,并利用Cytoscape 3.8.0软件筛选出核心作用靶基因;选取其中关键靶点和有效成分作为受体蛋白和配体小分子,使用Auto Dock Tools-1.5.6对配体和受体进行分子对接,并使用Pymol将分子对接结果进行可视化,从分子层面分析其治疗银屑病的潜在作用机制。4.实验验证,将30只BALB/c小鼠随机分为空白对照组(Blank)、模型组对照组(Model)、蒺藜止痒方组(JL),以口服给药7天;结束实验后,取小鼠背部皮肤组织,使用实时荧光定量PCR法检测HSP90AA1mRNA的表达,以补充蒺藜止痒方治疗银屑病的潜在作用机制的实验数据。研究结果:1.造模实验中,与空白对照组相比,使用IMQ连续涂抹小鼠背部皮肤7天造模,出现典型的红斑、鳞屑、皮损增厚等银屑病样改变,结合HE染色结果显示表皮角化层增厚,炎性细胞浸润,Munro微脓肿形成等提示造模成功。2.正式实验中,(1)各组小鼠一般情况较好,除Blank组外,各组小鼠体重均有下降。(2)与模型对照组相比,d8小鼠皮损改善,PASI评分下降,其中蒺藜止痒方低浓度组效果最明显;(3)与Blank相比,各组胸腺指数下降,而脾脏指数升高;IMQ刺激可使胸腺萎缩,脾脏增大。Positive、J-L、J-M与J-H组脾脏指数小于Model组,表明蒺藜止痒方可参与调控银屑病的免疫反应。(4)将皮肤组织进行HE染色,与Blank组相比,各组小鼠皮肤组织病理学均有改变,与Model组相Entinostat分子量比,HE染色显示,Positive、J-L、J-M与J-H各组皮肤组织表皮变薄。(5)ELISA检测显示,与Model组相比,Positive、J-L、J-M与J-H各组小鼠血清中IL-17A及TNF-α的表达下降,其中J-L组下降最显著,表明蒺藜止痒方可缓解银屑病的炎症反应。(6)小鼠皮肤表皮含水量的检测,与Model组相比,Positive、J-L、J-M与J-H各组小鼠皮肤表皮含水量升高,提示蒺藜止痒方可改善银屑病的干燥脱屑症状。(7)FLG表达的测定,与Model组相比,Positive和J-L组小鼠皮肤组织中FLG蛋白的表达量升高,J-L组的表达量升高明显,提示蒺藜止痒方可通过调节FLG蛋白的表达以修复银屑病皮肤屏障功能的损伤。3.通过网络药理学的研究方法,蒺藜止痒方中异鼠李素、木犀草素、槲皮素、山奈酚、β-胡萝卜素、β-谷甾醇等有效成分,通过CCND1、MYC、TP53、CTNNB1、TNF、HSP90AA1、CDK4、CCL2、NFKBIA和RELA等关键靶点与PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、T细胞Naporafenib溶解度受体信号通路、细胞凋亡等主要通路,以抗炎、调节免疫、调控细胞增殖与凋亡等途径发挥治疗银屑病的作用;且分子对接验证了木犀草素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素、β-谷甾醇、β-胡萝卜素与关键靶点CCND1、MYC、TP53、TNF、HSP90AA1、NFKBIA、RELA的结合稳定。本研究为未来实验验证蒺藜止痒方治疗银屑病的作用机制提供了指导方向。4.实验验证,与Blank相比,Model和JL小鼠皮肤组织中HSP90AA1mRNA的表达量的明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);与Model相比,JL小鼠皮肤组织中HSP90AA1mRNA的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.01),提示蒺藜止痒方可通过调节HSP90AA1mRNA的表达,以调控细胞的增殖和凋亡,参与机体的免疫调节和炎症反应进而改善银屑病的脱屑、瘙痒等症状。研究结论:1.蒺藜止痒方能有效缓解银屑病皮损处的红斑、鳞屑及表皮增厚等临床表现。蒺藜止痒方可下调相关炎症因子IL-17A和TNF-α的表达;影响免疫器官胸腺和脾脏的器官指数,表明蒺藜止痒方可通过参与炎症反应和免疫调节以减轻银屑病的临床症状。2.蒺藜止痒方可有效改善皮肤表皮含水量,显著增加FLG蛋白的表达以修复银屑病的皮肤屏障功能。3.蒺藜止痒方可能的潜在作用机制是抗炎、止痒、修复皮肤屏障、调控细胞的凋亡与增殖过程以及对体内免疫反应的调节作用;进而多成分、多靶点、多途径的协同发挥治疗银屑病作用。4.实验验证,蒺藜止痒方可促进HSP90AA1的表达,以抑制细胞的凋亡、参与机体的免疫调节和炎症反应而缓减银屑病的临床表现。