目的:胰岛移植早期胰岛细胞凋亡是NN2211体内实验剂量影响移植疗效的关键因素。伪胰岛(原代胰岛分离重聚)和异球体(原代胰岛分离后与其他种类细胞重聚)都属组织工程胰岛,SV2A immunofluorescence均可作为胰岛研究工具。本研究旨在:1.优化伪胰岛的构建方式,提高构建效率;2.进行伪胰岛及异球体功能活性评估,探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)参与构建的胰岛异球体能否改善胰岛移植效果;3.首次探讨hUC-MSC在胰岛异球体中的抗凋亡作用,为维持胰岛存活、改善胰岛移植效果提供参考。方法:通过组织贴壁法提取hUC-MSC,采用流式细胞术进行细胞表面抗原鉴定,进行三系诱导分化评估hUC-MSC的成脂、成骨、成软骨分化诱导能力;采用悬滴系统培养法(Akura~(TM)PLUS悬滴板结合超低吸附96U孔板作为收集板)将大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)和(或)hUC-MSC构建伪胰岛和异球体,比较悬滴系统培养法与培养皿悬滴法成球效率、不同细胞数量对伪胰岛和异球体的尺寸影响、伪胰岛和异球体的演变过程及形态学观察、异球体中hUC-MSC和INS-1的细胞分布;之后通过葡萄糖刺激试验、荧光素二乙酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)活性染色法检测制备好的(移植前的)伪胰岛及异球体功能活性,随后将伪胰岛和异球体移植到经链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型肝门静脉中,观察伪胰岛及异球体的糖尿病小鼠降血糖效果;与此同时,为验证hUC-MSC在胰岛异球体中的抗凋亡作用,通过H_2O_2诱导构建胰岛凋亡模型,于成球后分为3组:空白组(INS-1构建的伪胰岛)、模型组(INS-1构建的伪胰岛,采用50μmol/L H_2O_2诱导凋亡)、实验组(INS-1:hUC-MSC=1:1构建的异球体,采用50μmol/L H_2O_2诱导凋亡)。相同条件下培养72 h,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测胰岛细胞凋亡指数,RT-q PCR检测Bcl-2、Bax及Caspase-3 m RNA相对表达量,Western blotting检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白相对表达量。结果:1.经组织贴壁法提取的原代hUC-MSC约于培养3-7天后于组织块边缘爬出。当hUC-MSC密度较低时,其形态呈现出比较疏松的状态,细胞间距较大,细胞较为扁平,伸展度较高;当hUC-MSC密度变得较高时,细胞之间的距离变近,细胞呈现出较紧密的排列状态,细胞形态较圆润。另外,观察培养中的INS-1,增殖速度较快,发现其细胞形态为多边形或不规则多角形形状,细胞间贴附紧密。2.hUC-MSC表面抗原鉴定发现CD90Trichostatin A临床试验(99.79%)、CD105(99.71%)、CD73(99.89%)呈阳性,HLA-DR(0.07%)呈阴性。钙沉积物的存在表明hUC-MSC具有分化为成骨细胞的潜力,而观察到细胞内脂肪滴的产生是脂肪细胞的一个突出特征,阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的酸性粘多糖。3.悬滴系统构建的伪胰岛和异球体为类球形,对比项目组提取的人类胰岛发现,三者形态较为相近。4.通过对不同细胞数量的INS-1进行伪胰岛构建,发现随着细胞数量的增加,伪胰岛直径呈逐渐增加的趋势,INS-1起始细胞数量为300时,伪胰岛直径约为150.17±6.47μm,相较于200、250及350的INS-1伪胰岛直径(分别为119.01±4.36μm、130.86±5.21μm和166.35±5.84μm),差异有统计学意义(P<0.05);异球体组细胞直径172.65±6.15μm,对比350 INS-1细胞数量,差异无统计学意义(P>0.05)。5.悬滴系统与培养皿悬滴法成球情况比较发现,悬滴系统伪胰岛构建时间(52.44±13.37 h)快于培养皿悬滴法构建伪胰岛时间(113.54±24.99h),两者相比,差异有统计学意义(P<0.01)。6.研究伪胰岛及异球体的形成过程时发现,当注入悬滴培养板0 h时观察到伪胰岛组及异球体组细胞均较分散,呈不均匀分布,同时可见异球体组细胞数量明显多于伪胰岛组;约12 h时两组均可见明显的细胞汇聚现象,细胞聚集成片状,略分散,紧密程度差;24 h时异球体组可见明显细胞聚集,已基本变为类球形,伪胰岛组肉眼观察到细胞聚集,但是其致密度不高,异球体组明显优于伪胰岛组的成球情况。待将伪胰岛及异球体收集到收集板中后,约24 h后可见两组均明显成球,两组均为类球型,形态较规则,异球体组球体直径略大于伪胰岛组。7.异球体制备后,异球体中INS-1被标记为红色,hUC-MSC被标记为绿色,两者合并后,可见INS-1和hUC-MSC呈不均匀间杂分布。8.制备好的异球体的整体细胞存活率高于伪胰岛,差异有统计学意义(P<0.05)。9.低糖刺激时,异球体胰岛素释放量均高于伪胰岛,差异有统计学意义(P<0.01);高糖刺激时,异球体胰岛素释放量均高于伪胰岛,差异有统计学意义(P<0.05);胰岛素释放指数(SI)异球体与伪胰岛相比,差异无统计学意义(P>0.05)。10.在糖尿病模型建立前一周,实验动物的血糖和体重保持相对稳定。在注射STZ后的次日(第8天)进行血糖测定,发现较前一天(第7天),3组小鼠的血糖均有明显升高(P<0.01),于第10天时,发现仅有1只小鼠血糖未达到20 mmol/L以上,在第11-13天,全部小鼠血糖持续稳定在20 mmol/L以上,第12天时有12只小鼠血糖达到30 mmol/L以上,第13天时有16只小鼠血糖达到30 mmol/L以上。移植后于次日(第14天)测定血糖发现,异球体组血糖降幅达8.05±1.45 mmol/L,伪胰岛组为6.7±0.72 mmol/L,空白组(生理盐水组)为3.9±1.34 mmol/L,伪胰岛和异球体组相对于空白组降幅均有统计学差异(P<0.01),但异球体组与伪胰岛组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在移植后1周内,空白组血糖水平有所回升接近移植前水平,而异球体组呈现先下降后呈缓慢上升趋势,但始终低于其他两组(P<0.05)。注射STZ后(第7天),3组动物体重呈持续下降趋势,组间差异无统计学意义(P>0.05)。移植一周内,3组小鼠体重均未见明显回升,对比第13天与第20天的体重降低幅度,三者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。11.凋亡诱导72 h后,流式细胞仪测定细胞凋亡百分率比较,经方差分析,模型组相对于空白组,凋亡率显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);实验组相对于模型组,凋亡率显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。12.空白组、模型组、实验组凋亡诱导后,经方差分析,与空白组相比,模型组Bax、Caspase-3 m RNA相对表达量均升高(P<0.01),Bcl-2m RNA相对表达量降低(P<0.01),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05);与模型组相比,实验组Bax、Caspase-3 m RNA相对表达量均降低(P<0.01),Bcl-2 m RNA相对表达量和Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)。13.空白组、模型组、实验组凋亡诱导后,经方差分析,与空白组相比,模型组Bcl-2蛋白相对表达量降低(P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白相对表达量均升高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01);与模型组相比,实验组Bcl-2蛋白相对表达量和Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01),Bax蛋白相对表达量均降低(P<0.05),Caspase-3蛋白相对表达量降低(P<0.01)。结论:1.悬滴系统培养法可提高伪胰岛的构建效率;2.hUC-MSC参与构建的胰岛异球体可改善胰岛移植效果;3.hUC-MSC参与构建的胰岛异球体可能显著抑制胰岛细胞的凋亡;4.hUC-MSC在胰岛异球体中的抗胰岛细胞凋亡作用途径可能包括:升高Bcl-2的m RNA及蛋白表达,降低Bax、Caspase-3的m RNA及蛋白的表达,提高Bcl-2/Bax m RNA及蛋白的比值。