目的:本课题旨在确定动脉粥样硬化性血管疾病发病机制中与氧化应激和免疫浸润细胞相关的生物标志物,并且进一步探讨生物标志物可能参与动脉粥样硬化坏死核心形成和破裂的作用机制。方法:基于Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中的GSE100927数据集和基因集富集分析(gene set eElexacaftor分子式nrichment analysis,GSEA)得到的389个氧化应激(oxidative stress,OS)基因进行差异基因表达分析,共鉴定出74个与infectious ventriculitis氧化应激相关的差异表达基因(differentially expressed genes related to oxidative stress,DEOSGs)。使用“CIBERSORT”和“WGCNA”R包,比较动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)血管组织和健康对照组血管组织的免疫浸润细胞水平差异。将74个DEIOSGs与WGCNA关键模块基因(972个)取交集,得到27个与免疫浸润细胞相关的氧化应激差异表达基因(differentially expressed immune-related oxidative stress genes,DEIOSGs)。为了进一步识别关键基因,利用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。通过ROC分析确定对AS具有诊断价值的生物标志物。此外,在GSE57691数据集中对它们的诊断价值进行验证。通过相关性分析和单细胞分析进一步明确生物标志物主要与免疫细胞的种类相关。MMP9、ALOX5、NCF2、NCF1和NCF4被确定为AS的诊断标志物,相关分析和单细胞分析显示,5个诊断基因主要与巨噬细胞相关。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)证实MMP9、ALOX5、NCF2、NCF1和NCF4基因在ox-LDL干预的巨噬细胞内高表达。免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹法(western blotting)证实斑块组织中ALOX5高表达。在ox-LDL诱导的巨噬细胞模型中,通过转染si RNA敲低ALOX5。检测LDH反映细胞损伤和检测细胞活性氧(ROS)的变化反应细胞氧化应激状态。为了进一步探索氧化应激相关生物标志物参与动脉粥样硬化的作用机制,分别将铁死亡基因集、坏死性凋亡基因集和焦亡基因集与GSE100927的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)取交集以进一步探索潜在的分子生物机制。结果:MMP9、ALOX5、NCF2、NCF1和NCF4被确定为AS的诊断标志物。PCR结果证实在ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞中上述分子显著高表达。在高脂喂养APOE~(-/-)小鼠血清中ALOX5蛋白表达明显高于对照组,提示ALOX5可以用于临床中动脉粥样硬化病人的血清学生物标志物。免疫组化和western blotting证实在高脂喂养APOE~(-/-)小鼠动脉组织中,ALOX5的表达水平显著高于对照组。单细胞测序分析表明ALOX5主要表达于斑块内的巨噬细胞。通过检测LDH反映细胞损伤情况:ox-LDL可以诱导巨噬细胞损伤,损害细胞活力。在ox-LDL诱导的巨噬细胞中,ALOX5的表达水平高于正常对照组。转染ALOX5 si RNA能够降低RAW264.7巨噬细胞中ALOX5的表达水平并降低ox-LDL诱导的巨噬细胞中的ROS含量。将铁死亡基因集、坏死性selleckchem VP-16凋亡基因集和焦亡基因集与DEGs取交集进行分析,结果表明:ALOX5是调控AS发生发展过程中斑块内巨噬细胞铁死亡的关键分子。结论:MMP9、ALOX5、NCF2、NCF1和NCF4是AS的诊断基因,与氧化应激和多种斑块内免疫浸润细胞相关。ALOX5可能作为铁死亡调控基因介导巨噬细胞死亡促进斑块坏死核心形成。