脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是全世界意外死亡的重要原因之一。即使是幸存者,也可能存在严重的神经功能障碍,造成巨额医疗费用和沉重的社会负担。脑基底节区富含白质纤维束,而脑出血最可能发生在基底节区。因此,脑出血后常常发生白质损伤(White matter injury,WMI),导致神经功能障碍和长期不良预后。然而,到目前为止,解决这一问题的有效策略仍然有限。研究表明,神经炎症发生在脑出血的早期,是导致WMI的主要因素之一。血红蛋白降解引起的炎症因子释放和小胶质细胞活化是导致WMI的重要原因。此外,炎症引起的脑血屏障损伤也会导致巨噬细胞浸润和脑水肿,从而加剧炎症反应。然而,对由炎症反应引起的WMI的干预措施同样是有限的。本文中我们发现了钾通道Kv1.3可能是改善脑出血后神经炎症,促进预后的关键靶点。早期文献报道,钾离子通道Kv1.3可能参与了脑出血后的炎症反应,使用Kv1.3的特异性阻断剂5-(4-苯氧基丁氧基)补骨脂素(PAP-1)能够引发炎症抑制效应,机制可能与血肿周小胶质细胞从M1亚型向M2亚型的转变有关。Kv1.3阻断尚未在ICH早期神经炎症小鼠模型中进行过测试,而抑制Kv1.3可能是促进ICH小鼠预后的潜在靶点。此外,血红蛋白富含铁。随着ICH介导的神经炎症进展到中后期,血红蛋白会逐渐降解,血红蛋白中的铁由是被释放,这种释放出的二价铁离子能够通过芬顿反应诱导活性氧(ROS)的产生,后者将导致髓鞘的降解。同时,血红蛋白释放的铁也可以成为脂质过氧化酶的组成部分,导致少突胶质细胞铁死亡和WMI。因此,靶向ICH后血肿周铁及其引发的氧化应激反应可能是减轻小鼠WMI的新方法。在本文中,我们发现了神经外科常用药右旋普拉克索(DPX)可能会减少白质纤维束铁介导的过氧化损伤及少突胶质细胞的铁死亡并改善WMI。这是一种用于不宁腿综合征,以及帕金森的辅助用药,已经被FDA批准上市,但在脑出血领域从未有报道使用。从机理上讲,DPX可能通过减轻铁沉积,ROS产生,增加谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁死亡抑制蛋白(FSP1)的表达而发挥作用。一.钾离子通道Kv1.3阻断在小鼠脑出血模型早期通过抑制神经炎症减轻WMI。目的探讨ICH后神经炎症引起的WMI以及PAP-1阻断Kv1.3的作用。方法通过向C57BL/6J小鼠(9-10周龄,24-26g)的基底节注射15μL血液建立ICH模型。然后将小鼠随机分为三组:ShamPacemaker pocket infection、ICH和ICH+PAP-1组。使用实时聚合物链反应(PCR)(n=3)、蛋白质印迹(WB)(n=3)和免疫荧光(IF)(n=3)检测ICH引起的Kv1.3随时间的表达变化情况。采用开放场试验(OFT)(n=8)、巴氏小鼠评分(BMS)(n=8)和小鼠体重变化(n=8)进行行为学评估。WB(n=3)、IF(n=3)和透射电子显微镜(TEM)(n=3)用于检测白质损伤。PCR、WB和酶Mirdametinib化学结构联免疫吸附试验(ELISA)(n=3)用于检测炎症因子。PCR(n=3)、WB(n=3)和IF(n=3)用于评估M1-M2小胶质细胞组成。结果1.与Sham组相比,ICH D3血肿周围Kv1.3表达显著增加。2.ICH后小鼠体重下降,尤其在D1-D3。Kv1.3阻断剂PAP-1缓解了体重下降。与Sham组相比,ICH组小鼠的BMS评分在D3时降低。而与ICH组相比,ICH+PAP-1组的小鼠BMS有所增加。OFT也具有相同的变化趋势,从不同剂量组的结果来看,40 mg/kg/d的PAP-1效果最佳。3.ICH组D3白质纤维束损伤明显,使用PAP-1 40mg/kg/d可减轻损伤。IF和WB均显示ICH中MBP表达减少,而ICH+PAP-1组与ICH组相比MBP表达增加。与Sham组相比,TEM D3脱髓鞘现象明显,G-比率显著增加,PAP-1在脱髓鞘和G-比率方面显示出强有力的保护作用。4.WB、PCR和ELISA实验均证实,相比于Sham组,ICH组小鼠脑血肿周炎症因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)表达增加,而PAP-1治疗组表达相对减少。5.相比于Sham组,ICH组抗炎因子如白介素-4(IL-4)和白介素-10(IL-10)表达增加,但在ICH+PAP-1组中,这些分子表达更高。6.与Sham组相比,ICH后血肿周围M1样小胶质细胞的数量增加,而PAP-1的应用减少了M1样小胶质细胞。7.与Sham组相比,ICH后血肿周围M2样小胶质细胞的数量增加,而PAP-1的应用使M2样小胶质细胞的数量甚至高于ICH组。8.ICH后NF-κB信号被激活,体现为p65和p50的磷酸化增多,这些l磷酸化可以通过使用PAP-1来消除。结论使用Kv1.3阻断剂PAP-1能够通过抑制NF-κB信号通路促进小胶质细胞极化为M2样小胶质细胞,减少了促炎细胞因子的积累,并上调了抗炎和神经营养因子的水平。以上药理作用最终缓解了WMI。二.普拉克索通过抑制小鼠脑出血模型中晚期铁介导的白质纤维束过氧化损伤促进预后目的检测右旋普拉克索在小鼠脑出血模型中的白质保护和铁介导的氧化应激抑制作用。方法小鼠生存率(n=10)和体重变化(n=8)用于DPX的效果和毒性评估。行为学测试,如BMS(n=8)、OFT(n=8)、衡量行走(BWT)(n=8)和前肢力量(n=8),用于评估是否服用DPX的预后差异。WB(n=3)、IF(n=3)、TEM(n=3)和苏木精伊红(HE)染色(n=3)用于白质纤维束损伤评估。Perl’s染色(n=3)和DHE染色(n=3)用于评估血肿周围的铁离子和自由基水平。TEM(n=3)用于寻找铁死亡特征性线粒体。WB(n=3)、IF(n=3)用于检测ICH后铁介导氧化应激分子机制。结果1.ICH组小鼠在BMS中的行为状况、OFT中小鼠的平均速度、前肢力量和BWT表现均比Sham组显著降低。DPX各剂量组均能改善小鼠的行为失能。5mg/kg/d的DPX在各剂量组中显示出最好的结果。2.相比于selleckchem diABZI STING agonistSham组,ICH组生存率和体重显著下降。ICH+DPX组与ICH组相比生存率和体重有所增加。3.ICH组白质损伤明显,MBP表达减少,血肿大小明显,脱髓鞘增加。相比于ICH组,DPX在ICH的D7能够发挥保护作用。4.ICH组第7天铁和ROS均增加。与ICH组相比,DP减轻了ICH D7上的铁和ROS积累。5.与Sham组相比,ICH组的线粒体皱缩百分比在D7时显著增加,DPX减少了收缩的线粒体。6.与Sham组相比,ICH D7时铁介导氧化应激相关基因的表达增加。DPX降低了铁介导氧化应激相关基因的表达结论ICH可引起长期WMI,在ICH的中晚期,白质纤维束可发生铁介导的氧化应激损伤。5mg/kg/d的DPX具有保护此种损伤的作用。机制可能与稳定线粒体膜电位,提高抗氧化分子GPX4和FSP1表达有关。