研究背景糖尿病肾脏疾病(diabeticNN2211抑制剂 kidney disease,DKD)是糖尿病最严重的微血管并发症之一,目前已超过肾小球肾炎跃居我国慢性肾脏病首位病因。DKD发病机制复杂,治疗费用高昂,药物不良反应发生率高,亟需寻找新的治疗靶点。线粒体是细胞的能量代谢中心,是众多致病因素首先作用的靶点。肾脏正常生理活动高度依赖线粒体供给能量,肾脏的线粒体含量在人体器官中位居第二,其中肾小管上皮细胞因其高代谢、高耗能的特性,拥有的线粒体数量明显高于肾脏其他细胞。此外,线粒体功能障碍一般在DKD早期出现且往往早于临床症状的发生。因此探讨线粒体损伤在DKD发病机制中的作用十分必要。线粒体生物合成和线粒体动力学稳态对维持线粒体功能具有重要意义。在正常生理条件下,线粒体生物合成和动力学相互依存,处于动态平衡之中;而DKD状态下,线粒体生物合成与融合减少,分裂增加,出现大量小的、碎片化的、无功能的线粒体,线粒体呼吸链复合物发生电子逃逸,生成大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),引发细胞凋亡。葡萄籽原花青素提取物(grape seedproanthocyanidin extract,GSPE)是一种从葡萄籽中提取的天然多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理作用。GSPE可有效减少DKD大鼠内质网应激,减缓肾损伤;在骨骼肌细胞中,GSPE可通过激活沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)及其下游分子过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅助活化因子 1α(peroxisomeproliferator-activatorreceptor ycoactivator-1α,PGC-1α)改善线粒体功能。而GSPE在DKD中的肾脏保护作用是否也能通过SIRT1/PGC-1α通路促进线粒体生物合成,改善线粒体功能,目前仍不明确。此外,在调节衰老和代谢紊乱中发挥重要作用的ShcA衔接蛋白家族成员p66Shc,能够调控细胞氧化应激和细胞信号转导途径,调节线粒体结构与功能。已有研究证实p66Shc与线粒体生物合成和动力学密切相关。而GSPE在DKD中的肾脏保护作用是否也能抑制p66Shc表达,调控线粒体生物合成和动力学稳态,保护线粒体功能,尚需进一步研究。因此,本论文假设p66Shc为GSPE的潜在治疗靶点,以此探索GSPE对DKD线粒体的保护作用,并设计相关实验加以验证。研究目的1.明确GSPE对DKD大鼠肾损伤的治疗效应,并阐明GSPE促进线粒体生物合成发挥肾脏保护作用的分子机制。2.明确GSPE能否维持高糖诱导下人近端肾小管上皮细胞(human kidney proximal tubular cells,HK-2)的线粒体生物合成和动力学稳态,能否减轻线粒体功能障碍。3.探讨高糖诱导下的HK-2细胞中p66Shc的表达变化及其在细胞氧化应激损伤和细胞凋亡过程中的作用。4.探讨p66Shc对HK-2细胞线粒体生物合成及动力学稳态的影响,及GSPE与p66Shc表达间的关系。研究方法1动物实验1.1将40只雄性SD大鼠均分为对照组、对照治疗组、模型novel antibiotics组、治疗组。腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)制备糖尿病大鼠模型,对照治疗组和治疗组灌胃GSPE,对照组和模型组灌胃等量生理盐水,连续给药12周。1.2 12周后测量大鼠体质量,检测大鼠血糖、血肌酐和尿微量白蛋白水平;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和过碘酸希夫(periodic acid Schiff,PAS)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜观察肾组织超微结构;原位末端转移酶标记技术评估肾组织细胞凋亡水平。1.3免疫组化及免疫蛋白印迹检测肾组织中线粒体生物合成相关蛋白:SIRT1、PGC-1α、核呼吸因子 1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)和线粒体转录因子 A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)表达。2细胞实验2.1体外培养HK-2细胞,转染质粒或si-RNA实现p66Shc的过表达或缺失。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和免疫蛋白印迹评估转染效率。2.2采用荧光探针检测HK-2细胞内和线粒体的ROS水平。流式细胞术检测线粒体膜电位的变化和各组别细胞凋亡率。2.3免疫蛋白印迹检测HK-2细胞中线粒体生物合成相关蛋白(SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM),线粒体动力相关蛋白1(dynamin-relatedprotein 1,Drp1)和线粒体融合蛋白1(mitofusins 1,MFN1)表达水平。研究结果1.GSPE能降低DKD大鼠血糖、血肌酐和尿微量白蛋白水平。2.GSPE能减轻DKD大鼠系膜细胞增生,减少肾小管结构破坏,减缓足细胞足突融合和基底膜增厚;改善肾小管上皮细胞中线粒体碎片化程度。3.GSPE能促进DKD大鼠线粒体生物合成,保护线粒体功能,减少肾脏细胞凋亡。4.GSPE能下调高糖诱导的HK-2细胞中p66Shc的表达,减少细胞凋亡。5.GSPE能减少HK-2细胞内和线粒体ROS产生,减少氧化应激损伤。6.GSPE能提升HK-2细胞线粒体膜电位,提高线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ和Ⅲ的活性,提升线粒体质量。7.GSPE能促进HK-2细胞线粒体生物合成,维持线粒体动力学稳态。研究结论本实验结果表明,天然抗氧化剂GSPE能通过下调Canagliflozin体内实验剂量p66Shc,促进线粒体融合及生物合成相关蛋白的表达,维持线粒体动力学稳态,减少氧化应激损伤,保护线粒体功能,减少细胞凋亡,减缓DKD的疾病进展。