亚急性瘤胃酸中毒(Subacute ruminal acidosis,SARA)是反刍动物养殖中常见代谢病之一,会导致有害代谢产物如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等大量释放并移位至血液,引起局部或全身性炎症反应,进而对动物机体产生许多负面影响,如加重瘤胃屏障功能受损等。芦丁是一种天然黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗菌等多种生物学活性,其对瘤胃炎症的干预作用未见报道,干预瘤胃上皮细胞炎症损伤的机制也尚未确定。因此,本研究选用绵羊瘤胃上皮细胞作为研究对象,以SARA产生的主要有害物质LPS为刺激物,建立瘤胃上皮细胞炎症损伤模型,探究芦丁对LPS诱导瘤胃上皮细胞炎症损伤的干预作用及其分子机制,为芦丁作为缓解高精料饲粮下反刍动物瘤胃上皮炎症等代谢性障碍疾病的饲用添加剂应用于反刍动物生产奠定理论基础。本论文研究分为四个试验,具体如下,试验一:绵羊瘤胃上皮细胞的原代分离与鉴定本试验采集健康绵羊的新鲜瘤胃组织,采用0.25%-0.02%EDTA胰蛋白酶对瘤胃上皮黏膜层进行不同时间的连续消化(30、20、15、10、8、5 min),成功分离得到绵羊瘤胃上皮细胞。镜下观察,细胞贴壁80%后进行消化传代,采用CK-18免疫荧光鉴定上皮细胞,细胞质荧光显示为绿色,DAPI染核为蓝色荧光,表明该上皮细胞为瘤胃上皮细胞。MTT检测细胞活力结果表明,第1 d为生长潜伏期,第2～6 d开始进入生长对数期,随后进入生长衰退期,细胞最佳接种密度为1×10~6/m L。试验二:瘤胃上皮细胞炎症损伤模型的建立本试验采用单因素试验设计,0、1、5、10、50、100μg/m L的LPS刺激瘤胃上皮细胞0、1、3、6、9、18 h,通过检测细胞活力、炎性因子含量及其相对表达量,筛选LPS最佳作用浓度和作用时间,并建立炎症损伤模型。结果表明,(1)与对照组相比,LPS刺激瘤胃上皮细胞6 h时,各浓度均显著抑制细胞活力(P<0.05),但细胞活力仍在0.8以上,9、18 h时,各浓度均极显著抑制细胞活力(P<0.01),但18 h时细胞活力下降至0.35,不利于后续试验;(2)与对照组相比,1、5、10、50μg/m L的LPS处理瘤胃上皮细胞均可以极显著提高TNF-α的含量以及IL-1β、IL-8、IL-12、TNF-α的m RNA表达量(P<0.01),显著提高IL-1β的含量以及IL-6的m RNA表达量(P<0.05),极显著降低L-10的含量以及IL-4、IL-10的m RNA表达量(P<0.01),说明所选LPS作用浓度均可引起瘤胃上皮细胞的炎症反应。综上试验结果,确定LPS作用浓度1μg/m L,作用时间9 h建立瘤胃上皮细胞炎症损伤模型。试验三:芦丁对瘤胃上皮细胞炎症损伤的干预作用本试验采用单因素试验设计,0、25、50、100、150μg/m L的芦丁刺激瘤胃上皮细胞0、2、4、6、8、10 h,检测细胞活力;同时在上述瘤胃上皮细胞炎症损伤模型的基础上,加入不同浓度的芦丁(0、25、50、100μg/m L),计算细胞相对增殖率,筛选芦丁最佳干预浓度和最佳干预时间。结果表明:(1)与对照组相比,芦丁刺激8 h,可以显著提高瘤胃上皮细胞活力(P<0.05);芦丁刺激10 h,可以极显著抑制瘤胃上皮细胞活力(P<0.01);(2)100μg/m L的芦丁可以最大程度地缓解LPS诱导的瘤胃上皮细胞损伤,细胞相对增殖率为70%。因此,确定芦丁的最佳刺激条件为浓度100μg/m L,时间8 h。在上述研究基础上,采用单因素试验设计,将第2代瘤胃上皮细胞随机分成对照组(CON组,无任何添加)、LPS损伤组(LPS组,1μg/m L,9 h)、芦丁组(Rtick endosymbionts组,100μg/m L,8 h)和芦丁干预组(R+LPS组,芦丁100μg/m L,8 h+LPS 1μg/m L,9 h),检测细胞因子、调控因子、紧密连接蛋白基因表达量及细胞因子含量、紧密连接蛋白蛋白表达量。结果表明,(1)与对照组相比,LPS刺激绵羊瘤胃上皮细胞可以极显著提高IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、INF-γ、CXCL8、CXCL9、TLR-4、My D88、NF-κB、IFIT3、TRAF6的m RNA表达量(P<0.01),显著提高IL-1β、TNF-α的含量(P<0.05),显著下调Claudin-4、ZO-1的m RNA表达量以及IL-10的含量(P<0.05),极显著下调Claudin-1、Claudin-4、Occludin的蛋白表达量(P<0selleck产品.01);(2)与对照组相比,芦丁可以极显著降低IL-1β、IL-12、TNF-α、INF-γ、CXCL9、TLR4、My D88、NF-κB、IFIT3、IRAK1、TRAF6的m RNA表达量(P<0.01),显著降低TNF-α的含量(P<0.05),极显著提高IL-10的含量(P<0.01),显著上调Claudin-1、Claudin-4、Occludin和ZO-1的m RNA表达量(P<0.05),极显著上调Claudin-1、Claudin-4、Occludin和ZO-1的蛋白表达量(P<0.01);(3)与LPS组相比,R+LPS组可以极显著降低IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、INF-γ、CXCL8、CXCL9、My D88、NF-κB、IFIT3、IRAK1、IRF3、TRAF6的m RNA表达量以及TNF-α的含量(P<0.01),极显著上调IL-4、IL-10、ZO-1、Claudin-4的m RNA表达量、Claudin-1、Claudin-4、Occludin、ZO-1的蛋白表达量以及IL-10的含量(P<0.01),显著降低IL-1β的含量(P<0.05)。以上结果说明芦丁能够缓解LPS对瘤胃上皮细胞造成的炎症、以及细胞间紧密连接的损伤,并且能显著提高瘤胃上皮细胞的抗炎能力、改善上皮细胞PR-171抑制剂的屏障功能。试验四:芦丁干预瘤胃上皮细胞炎症损伤的分子机制结果表明,(1)与对照组相比,PDTC组极显著降低IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、INF-γ、CXCL8、TLR-4、My D88、NF-κB、IFIT3、IRAK1、IRF3、TRAF6的m RNA表达量以及P-IκBα、P-NF-κB65、P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK1/2、P-ERK5的蛋白表达量(P<0.01);(2)与LPS组相比,PDTC+LPS组可以极显著下调IL-1β、IL-12、TNF-α、INF-γ、CXCL8、CXCL9、TLR-4、My D88、NF-κB、IFIT3、IRAK1、IRF3、TRAF6的m RNA表达量以及P-IκBα、P-NF-κB65、IκBα、NF-κB65、P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK1/2、P-ERK5的蛋白表达量(P<0.01),极显著上调IL-4、IL-10的m RNA表达量(P<0.01);(3)与LPS组相比,R+LPS组极显著降低P-IκBα、P-NF-κB65、IκBα、NF-κB65、P-P38MAPK、P-JNK、P-ERK1/2、P-ERK5的蛋白表达量(P<0.01)。综上结果说明,芦丁可以通过调节NF-κB/MAPK信号通路发挥抗炎活性。综上所述,芦丁主要通过作用于NF-κB/MAPK信号通路缓解LPS诱导的绵羊瘤胃上皮细胞炎症损伤,降低炎症细胞因子、细胞调控因子相关基因表达与分泌,增加紧密连接蛋白在转录与翻译水平上的表达,增强机体的抗炎活性,保护细胞屏障功能的完整性。