幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性菌,已经在1994年被列为I类致癌因子。全世界约有50%的人感染H.pylori,H.pylori感染正常胃粘膜细胞后会发展为胃炎、肠化生甚至是胃癌,感染H.pylori十年以上会发展为胃癌。H.pylori通过分泌各种毒力基因适应人类恶劣的胃环境,这些基因使细菌能够在酸性环境中存活,向胃上皮运动,并附着在胃上皮细胞上,引起慢性炎症和组织损伤,最终可能导致胃癌的发生。目前治疗H.pylori主要是使用两种抗生素联合一种质子泵抑制剂和铋剂,然而抗生素治疗始终存在一些副作用并且细菌的耐药性在逐渐提高,因此我们需要开发新方法治疗和预防H.pylori感染。本课题组利用高效液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和一代测序技术对石家庄地区H.pylori表达的外膜蛋白(out membrane protein,OMP)和尿素酶B亚单位(Urease B,UreB)进行鉴定和分析,制备了针对OMP和UreB的单克隆抗体和疫苗。针对OMP和UreB的单克隆抗体在体外能够抑制H.pylori的活性;针对UreB的蛋白疫苗在小鼠体内能够诱导产生T细胞免疫和B细胞免疫,为治疗和预防H.pylori感染提供新的思路。第一部分基于蛋白组学和一代测序技术分析幽门螺杆菌外膜蛋白及尿素酶氨基酸序列变化目的:用高效液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)对从石家庄地区59位幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染者分离菌株的外膜蛋白(out membrane protein,OMP)进行鉴定,分析不同菌株OMP成分中蛋白表达差异;选取一株表达血型抗原结合蛋白A(Blood-group-antigen-binding adhesin,Bab A)菌株进行传代培养,分析传代培养后OMP的表达变化及其致病性改变;用一代测序技术分析石家庄地区不同菌株尿素酶B亚单位(Urease B,UreB)氨基酸序列的多样性,为当地预防和治疗H.pylori提供参考。方法:1.用分区划线分离法培养59株石家庄地区H.pylori菌株,用尿素酶实验和革兰染色方法验证单菌落,用LC-MS实验分析59株菌株的OMP谱的差异。2.选取一株表达Bab A蛋白H.pylori菌株,用分区划线分离法培养,培养48 h为1代,传代至第30代。3.利用传代的第1代和第30代H.pylori分别感染胃癌细胞株AGS和正常胃粘膜上皮细胞株GES-1,用q RT-PCR实验验证传代培养后H.pylori刺激上述细胞产生白介素8(Interleukin 8,IL-8)水平的变化;用细菌粘附实验检测传代培养后H.pylori对AGS和GES-1细胞粘附能力的改变。4.用PCR实验扩增UreBbiomedical materials基因,琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物的长度是否符合预期;用一代测序技术分析比对21株H.pylori中UreB序列,用DNAMAN软件分析21种菌株UreB氨基酸序列的差异。结果:1.分区划线分离法成功培养59株石家庄地区H.pylori菌株,获得单个菌落,尿素酶实验结果为阳性,革兰染色结果显示,单个菌落为红色、杆状,证明单个菌落为H.pylori。2.用LC-MS技术对59株H.pylori菌株OMP进行鉴定,71%(42/59)的菌株检测到表达Bab A;47%(25/59)的菌株表达唾液酸结合粘连蛋白(Sialic acid-binding adhesin,Sab A);37%(22/59)的菌株同时表达Bab A蛋白和Sab A蛋白。3.在H.pylori菌株传代培养至第30代时,与第一代菌株OMP相比,有24种OMP种类均被检出,其中22种OMP的表达量在第30代菌株中降低,2种OMP的表达量在第30代菌株中升高。4.q RT-PCR结果显示,相比于第1代H.pylori,第30代H.pylori刺激AGS分泌IL-8的水平降低(P<0.01);第30代H.pylori刺激GES-1分泌IL-8的水平降低,但是差异不具有统计学意义,提示胃癌细胞可能对H.pylori的刺激更为敏感。5.细菌粘附实验结果显示,相比于第1代H.pylori,第30代H.pylori粘附AGS和GES-1细胞的能力均显著升高(P<0.001,P<0.01)。6.用PCR技术扩增UreB基因,琼脂糖凝胶电泳法分析结果显示,扩增的UreB位置正确,为1056bp,且条带单一;一代测序结果显示,21株H.pylori的UreB DNA序列的同源性为95%;用DNAMAN软件将UreB的DNA序列翻译成蛋白质,氨基酸序列的同源性为98%。小结:本部分实验成功培养了59株H.pylori菌株,不同H.pylori菌株表达的OMP谱不尽相同;H.pylori在传代培养过程中,OMP蛋白种类和表达水平均发生改变,且刺激AGS和GES-1细胞分泌IL-8能力降低,粘附AGS和GES-1细胞的能力显著升高;21株H.pylori的UreB基因DNA序列和氨基酸序列同源性大于95%,表明H.pylori菌株之间UreB基因相对保守,为下一部分实验提供参考。第二部分使用杂交瘤技术制备抗H.pylori Bab A_(385-447)(OMP28)和UreB_(321-339)单克隆抗体并验证抗体的中和能力目的:以H.pylori标准菌株J99 OMP Bab A_(385-447)(OMP28)和UreB_(321-339)为靶点制备多肽,用杂交瘤技术制备单克隆抗体,验证抗体在体外对H.pylori粘附能力和尿素酶活性的影响。方法:1.通过固相N-芴甲氧羰基法合成Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽,用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)鉴定多肽的纯度。2.通过骨髓瘤细胞融合、阳性筛选、亚克隆、小鼠腹水制备、抗体纯化制备针对两种多肽的单克隆抗体。3.用ELISA实验检测单克隆抗体的效价。4.通过尿素酶实验检测针对UreB_(321-339)多肽产生的单克隆抗体抑制尿素酶活性的改变;用细菌粘附实验检测针对Bab A_(385-447)多肽的单克隆抗体抑制H.pylori粘附AGS细胞的作用。5.用ELISA实验检测H.pylori感染者血清中针对Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽的抗体水平。结果:1.通过固相N-芴甲氧羰基法合成Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽,HPLC法分析结果显示,Bab A_(385-447)和UreB_(321-339)多肽纯度大于90%。2.通过杂交瘤技术制备了针对两种多肽的单克隆抗体;针对Bab A_(385-447)多肽获得了4种确认细节Ig G单克隆抗体;针对UreB_(321-339)多肽获得6种Ig G单克隆抗体。3.ELISA法分析结果显示,针对UreB_(321-339)多肽和Bab A_(385-447)多肽的单克隆抗体效价大于1:100000。尿素酶实验结果表明,当H.pylori和UreB_(321-339)单克隆抗体共孵育4h可抑制H.pylori的活性(P<0.01);粘附实验结果表明,H.pylori和Bab A_(385-447)单克隆抗体共孵育4h可显著抑制H.pylori粘附到AGS细胞的数量(P<0.001)。4.ELISA实验结果表明,H.pylori感染者血清中没有检测到针对Bab A_(385-447)多肽和UreB_(321-339)多肽的抗体。小结:本部分通过杂交瘤技术获得针对Bab A_(385-447)多肽和UreB_(321-339)多肽的Ig G单克隆抗体;抗UreB_(321-339)单克隆抗体和Bab A_(385-447)单克隆抗体在体外能抑制尿素酶活性和H.pylori粘附AGS细胞的能力;在H.pylori感染者血清中没有检测到针对这两种多肽的抗体,表明两种单克隆抗体可作为被动免疫治疗候选制剂。第三部分以H.pylori粘附相关OMP、毒力因子和UreB_(199-338)为抗原制备抗H.pylori多肽疫苗目的:以H.pylori粘附相关的OMP(Bab A、Sab A、Oip A)和毒力因子(Nap A、Cag A、Fla A、GGT、Hpa A、Fec A、Vac A、UreB)为靶点制备粘附因子多肽;以UreB_(199-338)为靶点制备多肽疫苗,并评估重组的UreB_(199-338)蛋白疫苗的免疫原性。方法:1.通过PCR扩增、酶切、酶连、转化、鉴定阳性克隆步骤制备pet28a(+)-粘附因子多肽质粒和p ET-22b(+)-UreB_(199-338)质粒。2.将质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导粘附因子多肽和UreB_(199-338)蛋白表达。3.用Ni-NTA亲和层析实验纯化粘附因子多肽和UreB_(199-338)蛋白。4.用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、Western blot和LC-MS技术鉴定纯化的粘附因子多肽和UreB_(199-338)蛋白。5.将佐剂Alum和UreB_(199-338)蛋白按照1:2的体积比混合,皮下免疫BALB/C小鼠100μg Alum-UreB_(199-338)和同体积的Alum,共2针。6.用ELISA实验检测Alum-UreB_(199-338)疫苗最后一次注射后,第21天和第35天BALB/C小鼠体内的抗体水平。7.用抗体粘附实验检测上述抗体抑制H.pylori粘附AGS细胞的变化。结果:1.基因测序结果表明,pet28a(+)-粘附因子多肽和p ET-22b(+)-UreB_(199-338)质粒构建成功。2.粘附因子多肽蛋白的分子量为27.96KD,通过考马斯亮蓝染色在SDS-PAGE胶上检测到25KD-35KD处有明显蓝色条带;Western blot法证实25KD-35KD的条带;LC-MS法分析结果显示,鉴定出的蛋白氨基酸序列跟目的蛋白序列完全匹配,证明纯化的粘附因子多肽蛋白为目标蛋白。3.重组的UreB_(199-338)分子量为16.10KD,通过Ni-NTA亲和层析方法纯化了UreB_(199-338)蛋白,通过考马斯亮蓝染色在SDS-PAGE胶上检测到17KD处有明显蓝色条带;Western blot法证实17KD的条带;LC-MS结果显示,鉴定的蛋白氨基酸序列跟目的蛋白序列匹配,证明纯化的UreB_(199-338)蛋白为目标蛋白。4.ELISA实验结果表明,Alum-UreB_(199-338)疫苗可诱导小鼠产生较高水平的抗UreB_(199-338)抗体。5.抗体中和实验结果显示,含特异性抗体的BALB/C小鼠血清与H.pylori共孵育后,显著抑制H.pylori粘附到AGS细胞的能力(P<0购买Dorsomorphin.001)。小结:本部分制备了重组H.pylori粘附因子多肽蛋白和UreB_(199-338)蛋白,重组H.pylori粘附因子多肽蛋白在大肠杆菌中得到有效表达,重组UreB_(199-338)蛋白疫苗免疫BALB/C小鼠可获得针对UreB_(199-338)的特异性抗体,该抗体在体外可显著降低H.pylori的粘附水平。结论本研究根据石家庄地区H.pylori菌株表达的OMP谱和UreB氨基酸序列制备了抗UreB_(321-339)、Bab A_(385-447)单克隆抗体和粘附因子、UreB_(199-338)蛋白疫苗,两种单克隆抗体在体外能抑制H.pylori尿素酶活性和粘附能力,UreB_(199-338)疫苗能诱导小鼠产生针对UreB_(199-338)抗原的特异性抗体,为进一步预防和治疗H.pylori提供参考。